免疫学分析方法第1篇

[关键词] 血吸虫病；免疫学检验；细胞

[中图分类号] R532.21 [文献标识码] B [文章编号] 1674-4721（2010）10（c）-070-02

在血吸虫病的免疫学诊断中，除试用过几乎所有的各种免疫学检验方法外，还有以血吸虫尾蚴和虫卵作为抗原的尾蚴膜试验和环卵沉淀试验。敏感性、特异性较高且使用广泛的主要的试验方法有皮内试验、环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验。

1 资料与方法

1.1 一般资料

为Ⅰ型变态反应试验。当经皮内注入血吸虫抗原时，抗原与相应IgE抗体结合，引起肥大细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒，释放组织胺使毛细血管扩张，血管壁通透性增强，出现丘疹和红晕等反应。成熟虫卵内毛蚴的分泌排泄物具有良好的抗原性，它从虫卵内渗出后；如与血吸虫感染者的血清作用时，可在虫卵周围形成特异性沉淀物。用可溶性血吸虫卵抗原致敏的绵羊红细胞与患者血清中的相应抗体，可呈现凝集反应。同间接ELISA，用日本血吸虫卵可溶性抗原包板，检测血清标本中的抗体。

1.2 方法

1.2.1 国内供应的血吸虫皮试抗原

有2种。一种为1∶8 000成虫干粉冷热浸抗原，另一种为1∶3 000新鲜成虫匀浆抗原。按无菌操作用结核菌素注射器，26号皮试针头于受试者前臂屈侧面注入血吸虫抗原0.03 ml。亦可用一直径0.5 cm的印章在前臂做一印记，注入抗原布满整个圆面积，注射量相当于0.03 ml。15 min后观察结果，测量丘疹的最大直径，凡等于或大于0.8 cm即为阳性反应[1]。

1.2.2冰冻干燥或热处理超声血吸虫卵

国内有成品供应。

1.2.2.1 用熔化的石蜡在洁净的载玻片上划两条相距约20 mm的直线，在蜡线之间滴加受试者血清2滴。

1.2.2.2 用针尖挑取干卵100～150个加入血清中，混匀，覆盖24 mm×24 mm盖玻片，盖玻片四周围石蜡密封。

1.2.2.3 置37℃温箱内48 h后，用低倍显微镜观察反应结果。如可疑阳性应在高倍显微镜下鉴别。

1.2.2.4 结果判读，典型的阳性反应是在虫卵周围出现泡状、指状或细长卷曲的带状沉淀物，边缘较整齐，有明显的折光。泡状沉淀物须大于10 μm（约相当2个细胞大小）。①反应强度用Ⅰ～Ⅲ表示：Ⅲ表示虫卵周围出现泡状沉淀物的面积大于虫卵面积，带状沉淀物相当于或超过虫卵长径的2倍。Ⅱ表示虫卵周围出现泡状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/2，带状沉淀物相当于或超过虫卵的长径。Ⅰ表示虫卵周围出现泡状沉淀物的面积小于虫卵面积的1/2，带状沉淀物小于虫卵的长径。②阴性反应：虫卵周围光滑无沉淀物，或有小于10 μm的泡状沉淀物及不论大小的球状及影状沉淀物[2]。阳性反应标本片要观察100个成熟虫卵，记录出现反应的卵数和反应的强度（计算环沉率，阴性者必须看完全片）。

1.2.3 商品化致敏红细胞试剂

国内有相应的供应。操作方法：严格按试剂盒说明书操作。①用微量滴管加4滴（25 μl/滴）0.9%氯化钠溶液于U型微量血凝板第一排、第二孔内，第三孔空白，第四孔加1滴。②第一孔内加待检血清，混匀，从中吸取血清1滴加入第二孔内，充分混匀后吸出2滴，于第三孔和第四孔各加1滴，在第四孔混匀后弃去1滴，使第三孔和第四孔血清稀释度为1∶5和1∶10。③将冻干致敏红细胞试剂按说明书用蒸馏水稀释后；用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于第三孔和第四孔各加1滴（25/μl），立即旋转震摇2 min，室温下静置1 h左右，观察结果。④判读标准同一般间接血凝试验，以血清大于或等于1∶10稀释出现阳性反应判为血吸虫病患者。

1.2.4 ELISA

①包被抗原，国内有成品供应。②其余试剂同一般ELISA。操作方法：同间接ELISA，原则上用1∶3 000稀释的1%日本血吸虫可溶性虫卵粗抗原包被聚苯乙烯板，每孔200 μl，置4℃过夜，洗涤后，分别加用吐温-PBS作1∶200稀释的血清标本，阴、阳性参考血清每孔200 μl。每个标本至少作双份。对照组不加血清，仅加PBS吐温，保温洗涤后，加适当稀释的酶标记抗人IgG，每孔200 μl。再经保温洗涤后，按常规加底物显色后，用酶标比色计，读取A492值。以4份邻苯二胺（OPD）底物及1份2 mol/L硫酸的混合液校正零点[3]。

2 结果

①加入虫卵数量要适当，虫卵过多或过少对反应结果都有一定影响。计算虫卵时，均不计未成熟卵和破卵。②检验每批血清标本，应同时做一阳性血清对照。③本试验可用于滴血滤纸代替血清进行反应；但将血滴洗脱时，血液被稀释反应强度因而下降。在我国一般不推荐干血滤纸方法乙目前有采用热处理超声干卵，PVC薄膜片环卵反应以及双面胶纸条环卵反应等。

3 讨论

皮内试验的临床意义：①本试验具有较高敏感性。粪检阳性者皮试阳性率95%左右，健康人的假阳性反应为2%～3%。与肺吸虫的交叉反应为7%～15%，儿童有时出现假阴性反应。②本试验一般作为一种普查过筛方法，阳性者再做进一步的检查。③对低年龄组人群进行皮内试验可检查有无新感染，和用以考核防治效果。④临床上对无血吸虫病史的疑似血吸虫患者，可先用皮内试验作为辅助诊断，如皮内试验阳性再考虑进一步确诊。⑤患者治愈后，在较长时间内皮内试验始终保持阳性反应，因此该法不能用于考核疗效。

环卵沉淀试验的临床意义：①患者阳性率平均为97.3%（94.1%～100.0%），假阳性率平均为3.1%（2.5%～5.6%），对华支睾吸虫病和丝虫病患者血清有0.5%严重的交叉反应，肺吸虫患者的交叉反应为6.4%。②患者接受有效治疗后，环卵反应强度逐渐下降。在流行区，人群环卵反应阳性率的变化可作为评价治疗效果，但反应阴转需时较长。

间接血凝试验的临床意义：本法敏感性在93%左右，假阳性率约为2%，肺吸虫病患者血清可出现交叉反应，治疗后本法阴转亦较缓慢。

酶联免疫吸附试验的临床意义：粪检虫卵阳性者的检出率为97%～100%，正常人假阳性率为2%～3%。与一般常见寄生虫无明显交叉反应。用本法检测曼氏血吸虫患者时，发现与旋毛虫有明显交叉反应。

检测血吸虫的各种试验成为临床辅助诊断的有效手段，在流行病学调查中尤具重要作用。

[参考文献]

[1]邹安琪,周东伟,江志群,等.脑血吸虫病的免疫诊断与治疗[J].江西医学院学报,2001,45(1):116-117.

[2]孙骏谟,田志雄,张在鹏,等.脑血吸虫病CT分型探讨[J].临床放射学杂志,1999,17(9):523-525.

[3]吴文泽,杜新华.螺旋CT延迟重复扫描对脑血吸虫性肉芽肿的诊断价值(附49例分析)[J].实用放射学杂志,2002,17(7):574-575.

[4]赵纯明,况小波.非限盐结合中药治疗晚期血吸虫病难治性腹腔积液的疗效观察[J].中国医药导报,2009,7(26):27.

[5]杜佐成.急性血吸虫病感染5例误诊体会[J].中国现代医生,2008,46(13):130.

免疫学分析方法第2篇

关键词:游离前列腺特异抗原,磁微粒化学发光酶免疫分析法,肿瘤标志物

Key words: prostate specific antigen,microbeads-based chemiluminescence immunoassay. Tumor marker

Gao wei

Kaifeng City Maternity Hospital

[Abstract]A sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay based on magnetic micro-beads was established to detect the free prostate specific antigen (f-PSA) in human serum. One antigen was coated on the magnetic micro-beads and the other was labled with horseradish peroxidase(HRP), with the highly sensitive Luminol chemiluminescence reaction as the detection system. The linear range of this method for PSA was 0.02~50ng/ml with the limit detection of 0.02 ng. The intra-assay coefficients of variation is lower than 4.7% and the percent recovery was in the range of 90%~110%. F-PSA in 510 clinical samples were detected with this method. Compared with Roche chemiluminescence immunoassays, the correlation coefficient of 0.995 was obtained. The results demonstrated that this method is reliable and shows proposed potential application in the clinical analysis of f-PSA for prostate cancer diagnosis.

前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)是人体前列腺上皮组织细胞分泌的一种分子量为30～33 kDa的单链糖蛋白分子[1～3]。前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)病人血清中PSA浓度升高;良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia, BPH)病人血清中,PSA浓度也会升高;随着年龄的增加,血清中PSA浓度也有不同程度的升高,在4～10 ng/ml的浓度范围就形成了诊断灰区[4~6]。PCa病人血清中f-PSA浓度水平与BPH病人以及正常人相比,明显偏低,游离前列腺特异抗原百分率对PCa的特异性更高,可降低临床检验筛查的假阳性率。建立特异性强、检测灵敏度高的新型f-PSA检测试剂将会对前列腺相关疾病的检测具有较高的临床应用价值。

1.材料及方法

1.1试剂: PSA、fPSA单克隆抗体购自美国Seradyn公司;辣根过氧化物酶、鲁米诺购自sigma公司;f-PSA化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒购自Roche公司。

1.2仪器:LUMO微孔板化学发光检测仪、IWO型洗板机(郑州安图生物工程有限公司);罗氏ELESYS2010电化学发光仪。

1.3临床样本:临床样本由肿瘤医院提供。

2.实验方法

2.1 方法学原理:选用一步反应双抗体夹心法检测f-PSA抗原。磁微粒表面结合PSA单克隆抗体;加入待检测校准品、临床血清和酶标记抗体;温浴反应后形成固相抗体-抗原-酶结合抗体的复合物,通过洗涤分离游离的抗原和酶标记抗体,加入发光底物,使用化学发光检测仪检测信号强度,结合标准曲线来实现对待测样品的定量分析。

2.2 抗体包被磁微粒:将300mg磁微粒分散于2ml包被液(0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液)中,室温下振荡4h,用20ml封闭液(0.5%BSA,pH 7.5磷酸盐缓冲液)封闭4h,最终使用封闭保存液调整磁微粒浓度30mg/ml,密封置于冰箱2～8℃保存备用。

2.2HRP抗体酶结合物的制备:采用改良过碘酸钠法完成HRP对f-PSA单克隆抗体的标记,酶结合物保持单克隆抗体的免疫反应活性和酶的催化活性。

2.3f-PSA校准品的配制:校准品经由国家标准标定,分装,冷冻保存。

2.4血清f-PSA的化学发光酶免疫分析方法:向微孔板中每孔加入校准品或样品50μL,磁微粒50μL,酶结合物溶液100μL,37℃温育30min,使用磁分离洗涤设备洗涤4次,加入发光底物100μL,室温避光反应5 min,测量相对发光强度单位(RLU),通过标准曲线对血清中f-PSA实现定量分析。

3.结果分析

3.1 包被浓度的影响:比较不同的包被浓度(1.0、2.0、3.0和5.0 ug/ml)对体系的影响。随着包被浓度的提高,校准品信号值升高,浓度达到3ug/ml后,校准品对应发光值开始下降,认为3ug/ml的包被浓度已经达到饱和。

3.2酶结合物浓溶优选:将酶结合物分别以1∶1000、1∶2000、1∶3000进行稀释,比较不同分析结果的影响。结果表明,在1∶2000稀释比条件下,校准品信号值、灵敏度、线性、HOOK值检出均达到最佳。

3.3温育时间:考察了不同温育时间对反应体系的影响,温育时间超过30min后,校准品信号值不再升高,表明免疫反应达到饱和,最终确定温浴时间为30min。

3.4温浴条件:考察了三种不同的温育方式,即4度、室温和37℃对反应体系的影响。37度时RLU较室温反应提高57%,同时考虑37℃恒温温育的条件更容易控制,选择37℃恒温温育作为温育条件。

3.5 性能评价

根据国家相关化学发光检测试剂质量标准,对建立的磁微粒化学发光f-PSA进行评价,结果如下:

临床考核研究选用本院电化学发光检测试剂为对照组。自2009年7月以来,收集经病理中心确诊前列腺患者血清样本43份、前列腺炎患者血清样本142份,随机收集正常男性血清样本325份。血清按照检测试剂盒要求采集的非抗凝血清,样本需清亮不混浊、样本量不少于300μl。采集后2~8 ºC冷藏,如1天内不检测,则应冷冻(-20ºC)保存,不得反复冻融。其测定值相关性及相关系数分别为:Y(磁发光) = 1.0075x (Roche)+ 0.0386R= 0.9953

4 讨论

本方法为化学发光酶联免疫系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定方法,它使双抗体夹心酶联免疫技术在游离标记抗体和抗原复合物中具有分离完全和快速的优点。建立的f-PSA检测方法重复性良好,线性范围宽,具有较高的精密性和准确度,特异性强。经过对510份临床血清研究表明与电化学发光检测结果符合程度达到0.99以上。

此方法操作简便、快捷,全部测定时间仅需40分钟,显著提高工作效率,满足医生及病人即刻出结果的要求。

参考文献:

1.Vessella RL , Lange PH , Partin AW, et al . Probability of prostate cancer detection based on results of a multicenter study using the Ax SYM freePSA and total PAS assay. Urology 2000 Jun ; 55 (6) :909

2.Djavan B , Zlotta A , Kratzik C , et al . PSA , PAS density , PSA density of transition zone , free/ total PSA ratio , and PSA velocity for early detection of prostate cancer in men with serum PSA 2. 5 to 4. 0ng/ ml . Urology 1999 Sep ;54(3) :517

3.张灵, 计国义, 李晓萌等. fPSA/ tPSA比值优化前列腺癌早期诊断作用的研究[J],中华男科学杂志,2004,8(10):582-585

免疫学分析方法第3篇

[关键词] 透明质酸；竞争化学发光酶免疫分析；肝纤维化

[中图分类号] O657 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0162-03

透明质酸（hyaluronic acid，HA），又称玻璃酸、玻尿酸（hyaluronic acid， HA），是一种独特的线性大分子黏多糖，分子式为（C14H21NO11） n。通常将玻璃酸及其反离子所生成的离子对或盐统称为HA[1-2]。HA是肝脏细胞外基质中蛋白多糖的一个组成成分，它由肝内间质细胞合成，内皮细胞摄取降解少量小分子亦由肾小球滤过。HA在血清中的含量对判断肝病的严重程度、鉴别有无肝硬化及预测肝病预后均有一定意义[3-5]。因此，血清HA检测已被单独或与其他标志物检测共同作为非侵入肝纤维化检测指标[6]。

化学发光免疫分析法（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）较既往的放射免疫分析法和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法具有无放射性污染、灵敏度高、特异性强、操作快速简便及易于自动化等优点，已广泛用于临床免疫检测中[7]。本研究采用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，通过对各种免疫反应条件的优化建立了竞争法人血清HA的CLEIA，并对其进行了方法学评价。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取60例第三二医院院确诊为肝纤维化患者的检测剩余血清，其中，男38例，女22例，年龄23～70岁，所有血清标本分离后于-80℃冻存。

1.2 仪器

化学发光检测仪为北京滨松光子技术有限公司BHP9507型，酶标仪为美国Thermo Labsystems MK3型。

1.3 试剂

人HA ELISA检测试剂盒购自美国RB（Rapidbio））公司，HA、牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）、鲁米诺、HRP、透明质酸结合蛋白（hyaluronic acid binding protein， HABP）及其单抗购自美国Sigma公司，其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司。

1.4 方法

1.4.1 HA和BSA的偶联 应用改良后方法[8-9]，偶联HA和BSA，制备透明质酸牛血清白蛋白（HA-BSA）用于包被，并保持其水溶性。

1.4.2 HABP的标记 应用改良过的碘酸盐氧化法[10]，用HRP对HABP单克隆抗体进行标记， 并保持单抗的免疫反应活性和酶的催化活性。

1.4.3 竞争法HA CLEIA检测方法的建立 经过抗体的包被、封闭、加HABP和待测样本或标准品、洗板、加二抗、洗板、加底物、上机读数等一系列步骤完成检测方法的建立，反应条件、标准品及反应液配制根据参考文献[11]介绍方法进行调整优化。

1.4.4 HA CLEIA检测方法的性能评估 按参考文献[11]所述方法，对检测方法的标准曲线与灵敏度、特异性、精密度、准确性、健全性、稳定性进行评估。

1.4.5 比对实验 对60例肝纤维化患者血清，应用CLEIA和ELISA方法同时进行检测，并对其相关性进行统计分析。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.0软件对所有数据进行统计分析。标准曲线绘制采用双对数回归法；灵敏度通过测定10个标准品零点（S0）浓度对应发光强度值，求出均值和标准偏差（standard deviation， SD），均值加2倍SD， 代入线性方程， 所得浓度即为灵敏度；精密度计算是对低、中、高两种不同浓度的质控血清，分别进行8孔平行测定，计算批内变异，将此操作重复10次，计算批间变异；回收率是在低于检测限的样品中加入HA，并测定其含量，并与加入量相比较，其结果用回收率表示；健全性通过回归分析计算；比对实验计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HA CLEIA检测方法各种反应条件的确定

应用棋盘阵列的方法经过反复优化，最终确定了如下反应条件：①以HA-BSA浓度为6.5 μg/mL碳酸盐缓冲液和1.5% BSA，分别对微孔板进行包被和封闭；② HABP加入浓度为56 μg/mL，体积为50 μL；③酶稀释度最终选定为1∶1000；④竞争反应时间为30 min，温度为37℃；⑤酶标抗体结合反应时间为30 min，温度为37℃；⑥检测时间确定为加入发光底物液避光反应10 min后。

2.2 HA CLEIA检测方法性能评估结果

2.2.1 标准曲线的确定 配制HA系列标准溶液浓度分别为25、50、100、200、400、800 μg/L，并进行测定。以相对发光强度（Y）对HA浓度（X）做双对数图，得到校准曲线回归方程为lgY = 2.260-1.16lgX，r = 0.9960。

2.2.2 灵敏度试验 经过5次重复测定，检测结果计算后得到最低检出限为6.12 μg/L。

2.2.3 特异性试验 选择层粘连蛋白、Ⅳ胶原和前Ⅲ型胶原3种人血清中共存的常见肝纤维化标志物，分别以高于各个指标血清浓度正常值10～100倍浓度加标，检测值均低于最低检测限（6.12 μg/L），确定与HA无交叉反应。

2.2.4 精密度试验 以高、中、低浓度质控血清， 8孔平行进行10次重复测定， 得出每次浓度值的批内差异和多次分析的批间变异，其相对标准偏差均小于

2.2.5 准确性试验 选择临床HA检测值低于下限的血清，分别加入10、500、1000 μg/L的校准品，重复5次检测后计算，回收率分别为101.2%、95.6%和93.5%。

2.2.6 稳定性试验 将各种反应物分别置于4℃和37℃，在3、5、7 d后进行检测，结果进行统计分析后显示相关系数均>0.98，标准偏差均

2.2.7 健全性试验 用零标准品血清系列稀释高浓度定值血清（12 ng/mL），然后进行检测， 用理论值和实际检测值做线性回归分析，r = 0.9662， 表明健全性良好。

2.3 比对实验结果

进行检验后，二者差异无统计学意义（P = 0.62 > 0.05）。见表1。

3 讨论

乙型与丙型病毒性肝炎是引起肝纤维化最常见的病因。在我国，乙肝的发病率和绝对患病人数都很高，其所引发的肝纤维化最常见。肝纤维化发生时，肝脏沉积的纤维结缔组织包括细胞成分和细胞外间质两大部分。细胞外间质有胶原、非胶原性糖蛋白、蛋白多糖，三者统称为细胞外基质（ECM）。肝纤维化发展过程中， ECM合成量增多，分解减少。通过肝穿刺对肝组织进行活检仍是目前判断肝纤维化程度的“金标准”，但它具有创伤性，且由于肝硬化在全肝中的不均一性，穿刺活检也有其局限性。因此，众多的研究开始寻找血清纤维化标志物，而目前认为ECM及其代谢产物是首选的血清标志物[6]，其中的HA是公认的较好的肝纤维化标志物，同时也可作为肝纤维化和肝硬化预后的指标[1-4]，并已在临床上广泛应用。

微孔板CLEIA是基于ELISA方法发展而来了的一种新技术，其操作步骤基本与ELISA相同，只是在结果检测时将ELISA法的酶标仪换为化学发光仪，较适于在国内推广使用。该方法相比ELISA法其灵敏度与特异性提高了很多，在原理上与ELISA的最大区别在于，将原有的底物显色更换为H2O2-鲁米诺（luminol）发光体系。鲁米诺，又名发光氨，化学名为3-氨基邻苯二甲酰肼，常温下是一种黄色晶体或者米黄色粉末，是一种比较稳定的人工合成的有机化合物，其在碱性条件下是以单阴离子的形式存在，当体系内加入H2O2和HRP后，H2O2及其中间体过氧化氢阴离子、HRP中的Fe3+即与鲁米诺反应形成不稳定的中间体，该中间体是一种内过氧化物，此内过氧化物迅速衰变成一电子激发态的氨基酞酸盐阴离子，继而发出光束，其最大光强度产生于425 nm。

本研究成功建立了基于竞争CLEIA的HA检测方法，比对实验表明该方法与进口ELISA方法等效，各种性能指标均能满足临床检测的要求，并且成本较低，有利于临床实验室的推广应用。

[参考文献]

[1] Sadik NA，Ahmed A，Ahmed S. The significance of serum levels of adiponectin，leptin，and hyaluronic acid in hepatocellular carcinoma of cirrhotic and noncirrhotic patients [J]. Hum Exp Toxicol，2012，31（4）：311-321.

[2] Yung S，Chan TM. Pathophysiology of the peritoneal membrane during peritoneal dialysis：the role of hyaluronan [J]. J Biomed Biotechnol，2011，32（11）：185-193.

[3] Poynard T，Munteanu M，Imbert-Bismut F，et al. Prospective analysis of discordant results between biochemical markers and biopsy in patients with chronic hepatitis C [J]. Clinical chemistry，2004，50（8）：1344-1355.

[4] Bar■i■N，Leroti■I，Smir■i■-Duvnjak L，et al. Overview and developments in noninvasive diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease [J]. World J Gastroenterol， 2012，18（30）：3945-54.

[5] Dallaverde Neto E. Septic arthritis due to Streptococcus bovis in a patient with liver cirrhosis due to hepatitis C virus： case report and literature review [J]. Rev Bras Reumatol，2011，51（5）：520-523.

[6] Adams LA. Biomarkers of liver fibrosis [J]. J Gastroenterol Hepatol， 2011，26（5）：802-809.

[7] Meibodi ES，Azizi MD，Paknejad M，et al. Development of an enhanced chemiluminescence immunoassay （CLIA） for detecting urinary albumin [J]. Mol Biol Rep，2012，39（12）：10851-10858.

[8] Grymonpré KR，Staggemeier BA，Dubin PL，et al. Identification by integrated computer modeling and light scattering studies of an electrostatic serum albumin-hyaluronic acid binding site[J]. Biomacromolecules，2001，2（2）：422-429.

[9] Filippov A，Artamonova M，Rudakova M，et al. Self-diffusion in a hyaluronic acid-albumin-water system as studied by NMR [J]. Magn Reson Chem，2009，14（8）：320-328.

[10] Sambrook J，Russell DW.分子克隆实验指南[M].黄培堂，译.北京：科学出版社，2002：1692.

免疫学分析方法第4篇

【关键词】化学发光；免疫分析；临床检验

在临床检验中常需要对各种表征性的物质进行检测分析来判断疾病或其他身体病理特征，电化学发光免疫分析技术（ECLIA）是电化学发光和免疫测定相结合的产物，是目前最先进的标记免疫测定技术，能对各种物质进行快速分析，该系统是由于在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，在分析化学中，化学发光是当基态分子吸收化学能，反应中释放的能量跃迁到激发态，使得处于激发态的分子以光辐射的形式返回到基态时产生的光。ECLIA检测法具有灵敏度高、准确度高、检测速度快等特点，特别适用于微量物质的测定。

1化学发光免疫分析的工作原理

化学发光免疫分析根据发光体系在免疫分析中的表现方式不同可分为：直接标记发光物质的免疫分析、电化学发光免疫分析和酶催化化学发光免疫分析。其中电化学发光免疫分析技术（ECLIA）是目前最先进的标记免疫测定技术，能对各种物质进行快速分析，灵敏度高，目前在临床中的应用极为广泛，可以检测细菌及病毒、检测肿瘤标志物和检测激素等。不同的发光体系他们的作用原理也不尽相同。

1.1直接标记发光物质的免疫分析该方法是直接用化学发光剂标记抗原或抗体。标记的常用化学发光物质有吖啶酯类化合物，吖啶酯类是有效的发光标记物，首先起动发光试剂然后试剂作用而发光，强烈的直接发光在1秒内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯因为其化学反应简单、快速、无需催化剂，而作为标记物用于免疫分析；在检测小分子抗原时通常采用竞争法，而大分子抗原则通常采用夹心法，不会因为与大分子结合而影响发光量。有人已经采用直接化学发光技术进行的全自动双抗夹心免疫测定方法，对患者血清B-HGC含量进行检测法，操作简便、敏感度高、特异性强、优于一般的酶联免疫法和放射免疫法［1］。

1.2电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析在电极表面进行反应，用三丙胺来激发光反应发光底物通常为三联吡啶钌。在阳极，这两种物质可同时失去电子，发生氧化反应。在电极板上三丙胺也在电极板上被氧化成三丙胺阳离子，与此同时二价的三联吡啶钌被迅速氧化成三价三联吡啶钌。激发态的二价三联毗啶钌在衰减的同时发射一个光子，然后重新回到基态二价三联吡啶钌。这一过程在电极表面反复进行，产生高效、稳定的连续发光，并不断增强。电化学发光免疫分析采用一种新型生物反应放大系统即链霉亲和素和生物素包被技术。以直径为218μm的磁性球作为载体，比板式的反应面积扩大了20-30倍，利用生物素与链霉素亲和素的牢固结合力，结合免疫放大能力和反应系统中的磁分离功能，使免疫反应在微球表面快速进行。并且，因为电发光过程产生许多光子，使光信号得以增强。因此，检测灵敏度提高，线性范围也可达6个数量级，可达到检测浓度小于1Pmol/L的超微量物质。有人已经采用电化学发光免疫分析法在检测乙肝标志物，结果发现用电化学方法检测灵敏度更高，专属性更强［2］。

1.3酶催化化学发光免疫分析从标记免疫方面分析，酶催化化学发光免疫分析应属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，因此与酶免疫分析的操作步骤完全相同：以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。例如常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。碱性磷酸酶所用底物为环二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团-金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团，在起动发光试剂作用下引起化学发光。冯艳铭等采用双抗体异位点夹心法［3］，用甲胎蛋白单克隆抗体作为固相包被，采用改良过碘酸钠法进行甲胎蛋白多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体，以CSPD作为底物，建立了人血清AFP的化学发光免疫定量分析法。

2化学发光免疫分析在临床的应用进展

2.1检测细菌及病毒细胞的是一切生命活动的基本组成单位，人体就是由千千万万的细胞集合而成，每个细胞就是一个独立的小生命，而控制着细胞的核心物质就是核酸，核酸是遗传物质基础，具有贮存、传递和表达遗传信息的功能。因此对标本中的核酸进行定量检测，对于临床准确、及时的诊断疾病，监测治疗效果是十分必要的。传统采用普通的细菌培养方法往往存在培养时间过长等诸多缺陷，因此，现在很多实验室都在寻求快速、灵敏的检测方法。研究表明用放大核酸序列分析的方法对食物中沙门杆菌进行检测，结果表明，应用化学发光免疫分析技术在16h后就可得到明确的结果，而且检测准确，操作简单。

2.2检测肿瘤标志物目前肿瘤是威胁人类生命健康的主要因素之一，也是死亡率最高的疾病之一。由于本身肿瘤发生的隐匿性及发展的侵袭性，多数患者发现晚，在确认时已有远处转移，早发现、早诊断、早治疗是提高肿瘤患者生存率和治愈率的关键。研究发现肿瘤的发生都有肿瘤标志物，它作为肿瘤的特有标志，对其的动态观察及测定，可为肿瘤的诊断、治疗及预后提供可靠的依据。化学发光免疫分析法可以对CEA、CA242、ferritin、CA199、F-PSA、NSE、β-HCG、AFP、HGH、PSA、CA125和CA153等十几种肿瘤标志物进行测定［4］。Sakizono等用ECLIA法检查36例肝细胞癌，其中有17例患者血清中PIVKA-Ⅱ升高，表明该检测法适用于检测血清微量PIVKA-Ⅱ，有利于肝癌的早期诊断。

综上所述，化学发光免疫分析具有多方面的优势，是一套有效性好、灵敏度高、准确度高、检测速度快的自动化免疫分析系统，能充分满足临床和科研试验的需求，与现实的应用密切联系起来，尤其适用于临床急诊检测。相信随着医学技术的不断发展，研究的不断深入，该法在临床的应用前景将是十分广阔的。

参考文献

［1］王利娜，姚智，等.电化学发光免疫分析技术检测乙肝标志物的应用［J］.天津医科大学学报，2008，14（1）：48-501.

［2］张瑞，贾良勇，等.电化学发光免疫分析法在HCG定量检测中的应用［J］.延安大学学报（医学科学版），2008，6（3）：108-1091.

免疫学分析方法第5篇

【关键词】学发光免疫分析技术；基本原理；分类；应用

文章编号：1004-7484（2013）-01-0463-01

化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immuno-assay，CLIA），是在二十世纪八十年展起来的，它是比荧光免疫测定、酶免疫、发射免疫更先进的一种最新的免疫测定技术。这种技术主要用于对各种抗体、抗原、半抗原、脂肪酸、激素和药物的检测分析，下面就介绍一下这种技术的基本原理和分类。

1化学发光免疫分析技术的基本原理

化学发光免疫分析技术是由免疫分析和化学发光分析两个系统构成的。其中免疫分析是用标记物直接标记在抗原或抗体之上的，然后再经过抗原与抗体反应生成抗体免疫复合物，其中标记物可以是化学发光物质，也可以是某种酶。化学发光免疫分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，待发光物质氧化后就会形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测，其中被测物的含量就是根据化学发光标记物与发光强度的关系利用标准曲线计算出来的。

化学发光的原理是指分子或原子中的电子吸收能量后，发生能级跃迁而释放光子的过程，能级跃迁过程是电子从基态到激发态的过程，实现了从较低能级向较高能级的跃迁。其中可以根据形成激发态分子的能量来源不同将发光过程分为化学发光（chemiluminescence）、光照发光（photoluminescence）和生物发光（bioluminescence）。

化学发光又可分为直接化学发光和间接化学发光，若参加反应的物质是一个反应产物分子，且被激发到能发射光的电子激发态，那么这就是直接化学发光过程。若参加反应的物质激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。

2化学发光免疫分析的分类

化学发光免疫分析根据应用于免疫分析体系中的方式不同，可以分为以下三类：

2.1直接标记发光物质的免疫分析这种分析方式是用吖啶酯直接标记抗体，作为抗原，然后与待测标本中相应抗体发生免疫反应，就会形成固相包被抗体一待测抗原一吖啶酯标记抗体复合物，到这一步后再加入双氧水氧化剂和氢氧化钠，这样环境就会呈碱性，吖啶酯就会在不需要催化剂的情况下分解、发光。

2.2酶催化化学发光免疫分析标本中的抗原（抗体）在发生免疫反应时所用的标记物为发光的酶，这种化学发光免疫分析方法是酶催化化学发光免疫分析。

2.3电化学发光免疫分析（ECUA）这种分析过程包括电化学和化学发光两个过程，具体是以三丙胺（TPA）为电子供体，用电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。

3化学发光免疫分析在临床检验中的应用

就目前而言，化学发光免疫分析技术已经成为替代RIA的首选技术，且已经被广泛地应用于基础和临床医学的各个领域。下面就简要地谈谈化学发光免疫分析技术在临床检验中的几个应用。

3.1应用于传染性疾病的病原诊断作为评价和治疗机体免疫功能重要指标的重要血清学标志物乙型肝炎病毒表面抗原、抗体，以前诊断是否感染乙肝病毒用的是常规酶法，常规酶法的缺陷是可能使得部分低病毒含量携带者漏检。但是化学发光免疫分析具有高灵敏度和线性范围宽的特点，在传染性疾病的病原诊断方面其检测灵敏度比常规酶法高，Bowser等在测定感染人类免疫缺陷病毒的围产期儿童体内的单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒甲型肝炎病毒、及丙型肝炎病毒时给出了证明。

3.2应用于肿瘤标志物的分析肿瘤标志物包括蛋白质、酶、癌基因产物、激素等，它是由肿瘤细胞合成释放或机体对肿瘤细胞反应而产生的一类物质。在患者的细胞中，血液中以及组织中都存在肿瘤标志物。化学发光免疫分析可以用于寻找新的肿瘤标志物，也可以进行体外早期辅助诊断和对术后的监测，对恶性肿瘤患者的具有重要意义。Mac等达到了对食管癌患者的诊断和病情监测，他们采用的方法就是检测血清中癌胚抗原的浓度、cyfra21-1的浓度、鳞状细胞癌抗原的浓度。Shabin和Raslan比较了AFP和人绒毛膜促线性激素这胎膜早破和健康孕妇阴道液中的两种标志物，发现AFP的敏感性和特异性最高。Sakaida等通过检测细胞色素C的含量得出C可能成为肝衰竭的新标志物。

3.3应用于心脏疾病的特征标记物测定临床上的心脏疾病常常采用同工酶定量测定，标记物为肌酸激酶和肌钙蛋白T＼肌红蛋白。Dutra等运用心肌肌钙蛋白cTnT受体分子制成了免疫传感器，可用于临床上早期检测心肌梗死。有文献报道同时检测了cTnT肌酸激酶同工酶CK-MB和肌红蛋白，相关系数分别为cTnT0.953-0.982；CK—MB0.835-0.999；肌红蛋白0.776-0.992，具有很好的相关性可用于检测临床标本。

4结束语

化学发光免疫分析技术具有高特异性和高灵敏度的特点，它将化学分析方法和免疫学分析方法的优点融合了起来，用这种方法分析简便、快速，且标记结合物稳定，没有污染，是非放射性免疫分析方法中最有前途的方法。现在在临床诊断和治疗疾病中应用的全自动化学发光免疫分析仪能够实现试剂稳定自动分析，且可以在短时间内得出精确的结果，可以说化学发光免疫分析检测技术的应用必将为未来迎来新的曙光。

参考文献

[1]魏光伟，余永鹏，魏文康，罗胜军，WEI Guang-wei.YU Yong-peng.WEI Wen-kang.LUO Sheng-jun 化学发光免疫分析技术及其应用研究进展[J].动物医学进展，2010，31（3）.

[2]郑开作.化学发光免疫分析技术测定血清TSH及临床评价.福建分析测试研究报告，2001，10（3）：1458-1461.

免疫学分析方法第6篇

【关键词】 化学发光免疫分析技术;基本原理;分类;应用

近10多年来,当代生物技术的研究和应用取得高速发展的同时,也大大推动了化学发光免疫分析方法(CLIA))的更新换代速度。化学发光免疫分析法(CLIA)是建立在放射免疫分析技术(RIA)理论的基础上,以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法,具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、操作方便、分析速度快和容易实现自动化和不污染环境等优点,特别是能在较短的时间内得到实验结果,因此深受检验医学工作者和临床医师的好评。

1 化学发光免疫分析的原理

化学发光免疫分析技术的基本原理,化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发光分析两个系统[1]。免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化学发光物质经氧化剂的氧化后,形成一个处于激发态的中间体,会发射光子释放能量以回到稳定的基态,发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测[2]。根据化学发光标记物与发光强度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的含量。

2 化学发光免疫分析的分类

化学发光免疫分析根据应用发光体系应用于免疫分析中的方式不同可分为直接标记发光物质的免疫分析,酶催化化学发光免疫分析,电化学发光免疫分析(ECLIA)。直接标记发光物质的免疫分析,目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。

3 化学发光免疫分析的临床应用

CLIA已广泛应用于基础和临床医学的各个领域,成为替代RIA的首选技术。Amersham公司针对AmerliteTM发光增强酶免疫分析系统研制出的试剂盒项目有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素,与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮,以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。Amersham公司虽然研制出这10余种试剂盒,但因操作不够简便,检测项目仅限于蛋白质类大分子化合物,未能广泛应用于临床医学检测。

美国Ciba Corning公司研制的ACS:180自动CLIA系统能非常精确测量闪光。经过不断的改进,实现了ACS:180CLIA系统的全自动化,推出全新产品"ADVIA系列"。现有检测项目47项,更多的项目还在开发之中。主要有甲状腺系统、性腺系统、血液系统、肿瘤标记物、心血管系统、血药浓度及其他一些检测项目。

经过改良后,金刚烷衍生物在碱性磷酸酶作用下可发出高强度的辉光,光信号可持续1～2 h。随后国外生产厂家研制出以碱性磷酸酶为标记物的试剂盒,与之相匹配的有DPC的IMMULITE全自动CLIA系统和Beckman的ACCESS全自动微粒子CLIA系统。IMMULITE全自动CLIA系统可检测项目有心脏病、甲状腺功能、性腺激素、传染病、药物、血清学、血液病、成瘾药物、糖尿病、过敏检测和肿瘤标志物。ACCESS全自动微粒子CLIA系统主要可检测甲状腺功能、血液系统、内分泌激素、药物、肿瘤因子、心血管系统和糖尿病等项目。

目前商品化的ECLIA分析系统只有Roche公司的ECLIA全自动分析系统。主要特点是本底信号极微,特异性更高,最小检出值可达1 pmol以下,操作十分简便快速,是CLIA优点较为集中的完美分析技术。已提供试剂盒的项目有肿瘤标志物、甲状腺功能、内分泌、传染病、心肌标志物和维生素类等项目。

王阳[3]运用了电化学免疫分析技术,检测了3种肿瘤标志物癌胚抗原(Carcinoem-bryonic Antigen,CEA)、细胞角蛋白l9片段(Cytokeratin 19fragments,CYFRA21,1)和神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)水平,对肺癌诊断有实际应用价值。张忠英[4]等利用电化学发光免疫分析技术检测尿CK19片段,结果显示尿CK19检测对膀胱癌等泌尿系统肿瘤诊断和复发监测具有敏感性高、无创伤性的优点,优于血清CK19和尿细胞学检查。动态观察尿CK19片段含量的变化可降低急性尿感患者的假阳性率。王利娜[5]等应用ECLIA测定和酶免疫测定(EIA)检测乙肝标志物。结果:应用ECLIA方法检测HBsAg精密度,最大批内变异≤8.30%,最大日间变异≤15.33%,HBsAg灵敏度0.05 ng/ml,HBeAg灵敏度0.03NCU/ml。HBsAg检测范围0.01～7 000 COI。显示ECLIA检测HBsAg灵敏度高,重复性好,检测范围宽。检测HBeAg灵敏度可能更高。李锦洲[6]等采用ECLIA法对卵巢癌、良性卵巢肿瘤及健康妇女血清CA125分别进行测定,ECLIA用于第二代CA125(CA125-Ⅱ)测定,使CA125测定更加敏感恒定,每日之间差异较小。黄琛,汤汉红等[7]在ECLIA法检测与蛋白质芯片法多肿瘤标志物结果差异的研究中显示:两种方法有较好的相关性(P

化学发光免疫分析技术在医学的临床应用已非常成熟,有取代放射免疫分析技术和酶联免疫分析技术而成为诊断市场上的主流产品的趋势。国外的化学发光免疫分析检测系统价格昂贵,普及有一定的困难;国内的化学发光免疫分析检测系统虽然价格较国外产品便宜很多,但其检测的灵敏度和可靠性,还有待进一提高。研究者在如何提高免疫诊断的敏感性和特异性、发展新的分析体系和检测技术便携化等方面仍需要不断努力。

参 考 文 献

[1] 李美佳.当代免疫学技术与应用.北京:北京医科大学国协和医科大学联合出版社,1998:549-561.

[2] 翟艳,王卉.化学发光免疫分析及其进展.长春中医药大学学报,2009,25(4):619-621.

[3] 王阳.电化学发光免疫分析技术检测3种肿瘤标志物对肺癌的诊断意义.Chin J Lab Diagn,2006,10(3):294-296.

[4] 张忠英.电化学发光免疫分析技术检测尿CK19片段的临床应用及其评价.中华检验医学杂志,2005,28(1):50-53.

[5] 王利娜,姚智.电化学发光免疫分析技术检测乙肝标志物的应用.天津医科大学学报,2008,14(1):48-50.

[6] 李锦洲,洪锡田,吕晓娴.肿瘤标志物CA125检测在卵巢癌诊断中的价值.中国误诊学杂志,2005,5(8):1456-1457.

[7] 黄琛,汤汉红,王敏民.蛋白质芯片技术与电化学发光技术检测多肿瘤标志物结果的评价.天津医药,2008,36(12):942-944.

[8] 张瑞,贾良勇.电化学发光免疫分析法在HCG定量检测中的应用.延安大学学报(医学科学版),2008,6(3):108-109.

[9] 田润华,郑春喜,王士珍.电化学发光免疫分析与临床应用.齐鲁医学杂志,2004,19(5):464-465.

[10] 周建光,杨梅.电化学发光免疫分析技术与临床应用.医疗装备,2010,23(5):23-24.

免疫学分析方法第7篇

关键词：免疫检验；自动化分析；研究

现行临床免疫检验应用较多，特别是在肿瘤的发生、发展、复发及存活期期间，多依靠免疫检验帮助临床判断患者的当下情况，并未患者的治疗提供帮助。而在免疫检验自动化的发展过程中，也经历了诸多的变化，随着医疗设备的不断发展，免疫检验自动化也得到了巨大的进步，经过多年的研究，免疫检验自动化分析的操作步骤也在逐渐减少，检查报告结果更加准确详细，免疫检验已经从微量检测进一步发展为超微量检测[1]。而对免疫检验自动化进展总结分析，也具有较强的现实指导意义。

1免疫检验自动化的概念以及现状

1.1 临床免疫检验自动化的概念 免疫自动化检验指的是计算机控制检测仪器进行免疫检测分析，不需要人工操作。主要涉及三方面的工作：①加样品、分配试剂、以及洗涤和检测的自动化。②检测数据的自动化处理。③提示操作人员仪器出现故障以及解决办法[2]。

1.2现状分析 今年来临床免疫检验的工作量逐步增大，传染性疾病对检验人员的构成的风险不断加大，对检验工作的效率也提出了很高的要求，因此临床上免疫检验的自动化要求已经刻不容缓。自动生化分析技术在七十年代应用于临床检验实验室，经过二十年的发展，至九十年代免疫检验分析技术已经发展的越来越成熟，其中时间分辨荧光检测技术、化学发光检测技术等先进的分析技术不断的应用于临床免疫检验，这些检验技术灵敏度高、特异性好，抗干扰能力较强。

随着临床检验技术的不断发展，极大的促进了免疫检验技术的自动化的发展，很多自动化的分析仪应用于临床，大大降低了检验人员的工作强度，缩短了分析的流程，提高了检验结果的特异性以及准确性和灵敏度，所以自动化检验备受临床医学检验人员的青睐。

2临床免疫检验自动化的发展

2.1标记免疫检验技术的自动化发展 标记免疫指的是采用酶、放射性同位素等物质标记抗原或者抗体发生抗体、抗原反应。已经广泛应用于临床。由于其标记方法不尽相同，主要可以分为：放射免疫技术、酶标记技术、免疫荧光标记技术。其中临床检验中使用最广泛的是放射免疫技术和免疫荧光标记技术。但是两者都有明显的缺点，免疫荧光标记技术比较费时而且不能进行定量和自动化，放射免疫技术检测所需仪器复杂且价格昂贵，对人体危害比较大。酶标记技术则是一项易于操作的一项新技术，具有无需特殊设备、适用范围广泛、检测周期短等优点。

免疫标记检测技术主要具有两方面的优点：灵敏度高，测定目标由待测物转变为待测物上的微量标记物质，利用其放大效应，大大降低了待测物的检测下限，可进一步发展到超微量检测。特异性高，从传统的有机或者无机试剂发展为抗体和抗原，使得检测的特异性显著提高，随着酶试剂、稀土元素等更加灵敏、高效的标记物质的出现，免疫标记检测技术发展迅速，已经成为了临床免疫检验检测各种激素、肝炎抗体、肿瘤标记物等微量蛋白物质的主要检测分析手段[3]。

2.2 免疫浊度检测的发展

2.2.1 透射浊度检测法 免疫浊度的测定可以通过检测光源光路方向透射光的强度，分析其与测定溶液溶度的关系的方法。透射光的吸光度与待测定免疫物质的量呈现正相关，抗体量固定时，根据待测定免疫物质的吸光度，计算出相应抗原的量，这种方法的优点是只要试剂合适，在普通的生化分析仪上就可以进行全自动化的分析，可以使得人体液中的特异性蛋白质测定的准确度和灵敏度显著提高，检验流程更加简洁。

2.2.2散射浊度检测法 散射浊度检测法指的是波长一定的光照射溶液，当遇到抗原抗体复合物分子时，复合物颗粒导致光线折射，出现偏转，其偏转角度与光线波长以及复合物分子的大小和量有很大关系。光强度与抗原抗体复合物含量成正比，散射光强越强，那么形成的抗原抗体复合物也就越多。这种方法的优点是检测范围宽、检测速度快、敏感度高，但是要求所检测的抗体质量比较高。

3免疫检验自动化的总结

免疫检验自动化的主要技术参数主要有：临床检验中的抗体、抗原需具有高度的特异性和亲和力；检验中的固体载体一般为磁性微球，以达到增加免疫反应的面积的目的；自动化分析仪都要结合相关的计算机软件对测定的数据进行转化和分析。新的分析仪设计智能化程度不断提高，其自动化程度不断发展，已经成为了新时期临床免疫检验的最重要的检验方法之一。在不断的临床实践过程中，对临床免疫检验自动化的发展进行深入的研究。随着科学技术的不断进步，一些高灵敏度、高精确度的免疫检验技术将会广泛应用于临床，提高临床免疫学检验的效率，促使检验技术不断向着更高质量的方法发展。

参考文献：

[1]石云，罗萍，郭刚，等.创新性设计性实验在免疫学检验实验教学中的应用[J].现代医药卫生，2010，17（22）：41-42.

免疫学分析方法第8篇

【关键字】放射免疫法、化学发光免疫法、血清AFP、效果分析

【中图分类号】R426 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）07-4045-02

临床检测血清AFP中，应该对患者采用有效生长激素检测方式，这样才可以提高检测的准确性，提升患者的身体健康质量，提高治病疗效【1】。以下针对我院从2013年1月到2013年12月期间采集的100例住院患者血清标本进行分析，探讨临床中，采取化学发光免疫法与放射免疫法检测血清AFP的效果。

1 资料与方法

1.1资料

对我院2013年1月到2013年12月的100例住院患者进行血清标本收集工作， 本次研究的血清标本采集中，均是由经验丰富的检验人员在2小时内，对清晨空腹患者抽取静脉血3 ml，并排除患者有先天性疾病、心肝重要器官疾病；试验仪器包括德国罗氏公司的检测试剂盒，以及电化学分析仪、放射免疫分析仪、深低温；将患者随机分配成对照组与试验组，且在每组中都具有50例患者的血清标本，患者在性别、身体状况以及年龄等资料方面，相互进行比较后，不存在差异，无统计学意义。

1.2 方法

对于对照组患者血清标本检测中，将会使用XAKP- 2000A/02 型 γ 计数仪【2】，并应用中国原子能科学研究所提供的AFP 试剂盒，对患者的待检测样本进行梯度稀释，使检测物浓度在12.5～8000umol/L范围间，进行放射免疫法检测；对试验组患儿50例血清标本检测中，将会使用KL1- e411 型全自动电化学发光仪进行检测【3】，并稀释其检测样本的梯度，可以保持检测物浓度为12.5～8000umol/L，进行电化学发光法测定。对两组检测方法比较中，分析比对其检测血清AFP水平差异，考察其之间的相关性；并对两组检测方法中的低值、中值、高值进行记录试验，且测定每日测定每份样本22次，连续测20天，并考察批内CV值。

1.3 统计处理

对本次两组研究结果，可以应用统计学软件SSPS 12.0【4】，针对最后两组的检测结果进行处理， 在数据处理之中，计量资料我们将会用t检验进行比较，技术资料用x2检验，设置统计学的水准是a=0.05。

2结果

两组检测结果，电化学发光法检测血清AFP线性范围更宽，电化学发光法检测血清AFP精密、灵敏度度更高，其两组检测结果之间差异非常显著（ P

3讨论

据悉，血清AFP是检测原发性肝细胞肝癌的标志物，是最灵敏性、特异性的肿瘤标志，在临床肿瘤诊断中发挥重要作用。针对血清AFP检测中，应该制定合理的检测方案，才可以取得准确的检测结果，提高肝癌患者的生活质量。因此在临床诊断检测血清AFP中化学发光免疫法，较常规放射免疫法检验有较好的效果，可以提高检测结果的准确性、灵敏性、高度特异性。

化学发光免疫法检测血清AFP，在临床中具有较好的效果，应用化学发光系统作为抗原抗体反应指示系统，定量检测抗原、抗体，并应用发光剂标记抗体，与其它检测方法相比，具有很高的稳定性，采用机器自动加样，具有准确性，化学发光免疫法检测的线性范围较放射免疫法检测更宽，更适宜于临床检测 血清AFP。在血清AFP测定中，应用电化学发光法进行检查，可以采用高度的特异性抗体【5】，有效起到清除样本干扰的作用，提高检测结果的灵敏度，减少误差，使用电化学发光法测定血清AFP，临床检验效果更稳定。

由上可知，在临床中对血清AFP检测中，应用放射免疫法与电化学发光法检测进行检验，电化学发光法检测较放射免疫法更具应用优势，具有更好重复性，精密度高，有很好的临床效果，值得在实际在推广应用。

参考文献

[1] 张红祥. 化学发光免疫法与放射免疫法检测血清AFP临床分析[J]. 中国现代药物应用. 2010（07）

[2] 章茂友. 放射免疫法与化学发光免疫法检测血清AFP效果分析[J]. 中国现代医生. 2010（36）

[3] 张改英，王耀荣. 化学发光免疫法和放射免疫分析法测定血浆脑钠肽浓度的比较[J]. 疾病监测与控制. 2010（10）

免疫学分析方法第9篇

关键词：胶体金免疫层析技术；食品检测；应用情况

食品问题一直都是社会的焦点问题，直接关系到人们生活的质量，为了保障食品的安全，针对食品安全的分析检测技术也得到了不断的开发与应用，胶体金免疫层析技术便是其中的代表之一。本文就是关于胶体金免疫层析技术在食品检测中应用情况的分析。

一、胶体金免疫层析技术的分析

胶体金是一种氯金酸的水溶液，在柠檬酸三钠、白磷等还原剂的作用下，氯金酸聚合成大小特定的金颗粒，再在静电的作用下形成一种稳定的胶体溶液。胶体金颗粒本身就具有高电子密度的特点，当其颗粒的聚集到达某一特定密度时，就会产生能够通过肉眼看见的粉红色斑点，这就是可以将其作为免疫层析试验指示物的原因[1]。不同的还原剂可以制作不同的胶体颗粒，并在食物检测中发挥出显著的效果。

二、胶体金免疫层析技术在食品检测中的应用分析

胶体金免疫层析技术在医学领域中应用的是最多的，在食品检测行业中的应用是在近年来才出现的。从目前来看，胶体金免疫层析技术在食品检测行业中的应用主要是在食品质量控制领域与食品安全检测领域这两大领域中得到了大力的应用。

（一）胶体金免疫层析技术在食品质量控制领域中的应用分析

水分、脂肪、糖类、蛋白质、维生素、矿物质等是食品的主要成分，其中大部分成分都是有机高分子物质，可以使用免疫学方法对其进行检测。对于一些需要快速得到检测结果而不需要进行精确定量检测的成分分析而言，胶体金免疫层析技术是使用起来最为合理的一项技术，这类检测一般都只用进行半定量分析[2]。

例如通过SMZ―HAS免疫新西兰白兔制得抗体，选择胶体金来标记，包被在结合垫上。利用SMZ―OVA固相化在检测带之上，试纸条不存在质控带，样品中的SMA和SMZ―OVA竞争结合抗体，这种方法对于SMZ标准溶液的灵敏度可以超过50mg/ml，整个检测反应都是在10min内完成。

由于我国胶体金免疫层析技术在食品行业中的应用起步较晚，针对这一方面的研究暂时还比较缺乏，目前只涉及了保健食品的检测。比如对于牛初乳来说，其作为一种含有大量非营养组分的物质，保健价值极高。但是在初乳中，IgG的含量与这些生物活性物质含量有着非常紧密的关系，并且还是一种正相关的关系。因此，在对牛初乳或者与牛初乳相关的制品的生物活性指标进行评价的时候，主要就是对其中的IgG含量进行检测[3]。

（二）胶体金免疫层析技术在食品安全检测领域中的应用分析

为了获得更多的经济利润，在食品行业中有一些不法商家通过不正当甚至违法的手段来生产与加工食品，使得食品安全问题愈来愈严重。胶体金免疫层析技术在操作起来十分简便，检测用时短，在现场进行操作的时候非常方便，能够为食品安全问题的现场执法带来很多科学依据。

1、胶体金免疫层析技术在食品有害微生物中的检测

食品的卫生质量不过关，会引起食品中有害微生物超标的问题，食品中比较常见的致病菌主要有沙门氏菌、大肠杆菌、布氏杆菌、金黄色葡萄球菌等[4]。在对食品中致病微生物进行检测的时候，生化鉴定分离是最常规的方法，但是该方法操作起来十分复杂，不仅特异性低下，而且灵敏度也不高，在提早预防与即时监测中的作用也十分有限。而使用胶体金免疫层析技术能够解决这些不足，可以实现对食品中致病微生物的快速检测。

2、胶体金免疫层析技术在食品中生物毒素、农药、兽药残留物中的检测

很多食品中都会有生物毒素、农药等的残余物质，对消费者的健康造成了很大的威胁。在食品中，其残留的农药、兽药等物质多是一种半抗原的小分子物质，在制备抗体的时候要将其和大分子蛋白进行偶联来制备人工抗原。

以黄曲霉毒素B1为例，这是寄生曲霉菌与黄曲霉菌的二次代谢产物，是一种毒性非常强烈的致癌物，其有着非常稳定的理化性质，会对食品造成严重的污染，使得消费者的身体健康受到了极大的威胁[5]。在2005年的时候，相关专家就是用竞争免疫层析技术对食品中的黄曲霉毒素B1进行了检测，将抗AFB1单克隆抗体作为金标抗体，检测带为黄曲霉毒素B1-牛血清蛋白，质控带为羊抗鼠IgG，最终得到试纸条。

3、胶体金免疫层析技术在食品中违禁药物中的检测

在食品行业中，一些食品经营者以牟取暴利为经营目的，为了让食用者对其生产的食品成瘾，无视国家的相关法律法规，将罂粟壳等违禁药物加到调料、火锅汤料等食品中，对消费者的健康造成了很大的危害。罂粟碱、吗啡、可卡因等是罂粟壳的主要成分，在判断食品中是否含有罂粟壳的时候，可以通过检测吗啡、罂粟碱等的成分来加以判断。罂粟壳的大部分成分也是一种小分子物质，因此就可以使用跟农药类似的检测方法来对其加以检测。

使用柠檬酸三钠还原法对胶体金进行制备，并将胶体金标记方法来检测出牛还和猪肉中的磺胺二甲嘧啶残留样本，样本中的磺胺二甲嘧啶检测上限为20μg/kg，将这种方法和高效液相色谱法运用在检测牛奶和猪肉样品中，试条检测范围之内得到的结果和HPLC结果一致，这一检测在10min完成。

结语：

综上可知，胶体金免疫层析技术作为一种新型的标记技术，其凭借着无污染、简便、快速、结果准确率高等众多优点，在社会众多行业中都得到了良好的应用。为了能够更好的满足免疫层析分析方法的多方面要求，让胶体金免疫层析技术在食品检测中发挥出更大的作用，在今后必须要加快提高检测的敏感度与特异性，推动免疫层析在食品检测行业中得到更加合理的应用。

参考文献

[1]祁光宇，智晓莹，任维维，黄银军，牟克斌，刘学荣，王宇，蒋韬. 胶体金免疫层析技术在动物源性食品中的应用[J]. 东北农业大学学报，2010，04：156-160.

[2]张道宏，李培武，张奇，张文，丁小霞，王秀嫔，姜俊. 污染粮油食品的主要真菌毒素及胶体金免疫层析技术在快速检测中的应用[J]. 中国油料作物学报，2010，04：577-582.

[3]李宏，付冠艳，付淑君，钟菲菲，刘佩，曾林，杨丽霞. 胶体金免疫层析技术在食源性致病菌快速检测中的应用[J]. 食品与机械，2013，03：261-264.