免疫室自我鉴定总结第1篇

【摘要】

目的: 制备小鼠抗人烯脂酰辅酶A水解酶（enoyl CoA hydratase， ECHS1）的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体， 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠， 采用杂交瘤技术制备mAb， 并通过间接ELISA、 Western blot、 免疫沉淀、 免疫组化和间接免疫荧光等方法对mAb进行特异性鉴定， 通过Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原。结果: 获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb 的杂交瘤细胞株BGB095。该mAb的Ig亚类(型)为IgG1（κ）， 可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫沉淀、 免疫组化等实验。结论: 成功制备了抗人ECHS1的mAb， 为代谢疾病和肿瘤的研究提供了有力的工具。

【关键词】 ECHS1 单克隆抗体 线粒体

烯脂酰辅酶A水解酶（enoyl CoA hydratase， ECHS1）是线粒体脂肪酸β-氧化中的关键酶， 在第2步水化反应中催化烯脂酰辅酶A水化生成L-3-羟脂酰辅酶A［1］。线粒体脂肪酸β-氧化是体内脂肪酸分解供能的主要途径， 尤其是在主要能量来源葡萄糖缺少的情况下。遗传性线粒体脂肪酸β-氧化功能障碍导致一类相对较新的代谢疾病出现， 可以导致婴儿猝死综合征和瑞氏综合征等病症［2］。此外， 烯脂酰辅酶A水解酶作为线粒体脂肪酸β-氧化中的关键酶， 还在多种肿瘤如肝细胞癌、 肾细胞癌、 前列腺癌和结肠直肠癌等的发生发展中发挥着重要的作用［3， 4］。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体（mAb）库的建立中， 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb， 获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb的杂交瘤细胞株， 并对其特异性进行了鉴定， 这为进一步研究ECHS1在代谢疾病和肿瘤发生中的作用奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白和小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0由军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。BALB/c小鼠购自军事医学科学院动物中心; 福氏佐剂购自Sigma公司; HRP-羊抗小鼠IgG和TRITC-羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 蛋白酶抑制剂购自Roche公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; PVDF膜和ECL反应试剂盒购自Amersham公司; DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆700～750 r/min， 上下5次， 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液， 匀浆液用800 g离心10 min， 取上清， 10000 g离心10 min， 沉淀即为线粒体， 用匀浆缓冲液洗2次。用RIPA裂解液裂解线粒体样品， 离心后取上清， 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度， 计算线粒体得率， 通过测定匀浆液和分离的线粒体中琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度， SDS-PAGE鉴定抗原的相对分子质量（Mr）［5］。

1.2.2 鼠抗人ECHS1 mAb的制备 将线粒体总蛋白1 mg与等体积福氏完全佐剂进行充分乳化， BALB/c小鼠背部多点皮下注射。首次免疫后4周进行2次免疫， 1周后经尾静脉取血， 分离血清， ELISA法测定效价。融合前3 d进行加强免疫， 取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞进行细胞融合， 采用杂交瘤技术制备mAb。

1.2.3 抗原的鉴定 （1）免疫沉淀鉴定: 应用BGB095 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到相应的抗原， 加入5×还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备蛋白样品并进行SDS-PAGE电泳， 电转蛋白至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入BGB095杂交瘤细胞培养上清， 4℃孵育过夜， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP-羊抗小鼠IgG抗体（1∶5000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。（2）筛选Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库鉴定抗原: 取大肠杆菌XL1-BLUE MRF’过夜培养菌接种于LB培养液中， 37℃震荡培养至A600为0.8左右， 3000 r/min下离心10 min， 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5， 取适当稀释的文库60 μL（含约50000个噬菌体）与600 μL重悬的XL1-BLUE MRF’混匀后37℃温育20 min， 铺至150 mm的NZY-LB平板上， 42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见， 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖于其表面， 37℃继续培养3.5 h， 用防水墨水定位后， 剥离滤膜， 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆， 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。

1.2.4 BGB095 mAb的鉴定 （1）Western blot分析: 在线粒体总蛋白分别加入5×还原型或非还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备蛋白样品并进行SDS-PAGE电泳， 电转蛋白至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入BGB095杂交瘤细胞培养上清， 4℃孵育过夜， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP-羊抗小鼠IgG抗体（1∶5000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。（2）免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片， PBST浸洗5 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin50 mL（屏蔽体内生物素的作用）， 室温孵育15 min， 滴加30 mL/L H2O2-甲醇， 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭30 min， 加入杂交瘤细胞株BGB095的培养上清， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入HRP-羊抗小鼠IgG， 37℃孵育30 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后封片。（3）间接免疫荧光检测: 取达到对数生长期的单层Huh7细胞， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液， 接种至预先放置7 mm×22 mm盖玻片的6孔板内， 于37℃、 50 mL/L CO2细胞培养箱内培养30～35 h后， 罗丹明染色30 min， PBS清洗2次， 用40 g/L多聚甲醛固定10 min; PBS清洗3次后滴加羊血清工作液37℃封闭30 min; 滴加BGB095细胞培养上清， 4℃过夜; PBS清洗标本3次， 吹干; 滴加TRITC-羊抗小鼠IgG， 37℃孵育30 min; PBS洗3次; 500 mL/L甘油封片， 荧光显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 通过差速离心方法分离线粒体， 每克肝组织可得到8～10 mg线粒体蛋白。通过测定琥珀酸脱氢酶活性并计算线粒体富集度， 多次结果显示为线粒体富集度为4～7倍， 可作为免疫动物的抗原。

2.2 鼠抗人mAb的制备及初步鉴定 应用细胞融合、 筛选和克隆化， 获得1株抗人肝脏线粒体阳性的细胞株BGB095， 经ELISA检测效价约为1∶512000， 其亚类（型）为IgG1（κ）。

2.3 抗原特异性鉴定 （1）抗原的Western blot和免疫沉淀鉴定: 应用成人肝线粒体总蛋白和BGB095从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到的相应抗原进行Western blot分析， 结果显示， BGB095特异识别成人肝线粒体组织中Mr约为31000的蛋白（图1）。（2）筛选Uni-ZAP XR人肝脏cDNA表达文库鉴定抗原: 用获得的BGB095细胞培养上清对正常成人肝脏cDNA表达文库进行初次筛选， 挑取阳性噬菌斑进行复检， 得到单克隆的阳性噬菌斑约15个， 分离2个独立的阳性克隆进行体内剪切和测序。将测序结果进行Blast比对， 结果表明BGB095识别的抗原为烯脂酰辅酶A水解酶。为了对测序的阳性克隆进行进一步验证， 又对分离得到的阳性克隆进行了Western blot鉴定。结果显示， BGB095 mAb识别Mr为42000的重组表达蛋白， Mr较小的条带可能为降解产物（图2）。

图1 BGB095 mAb的Western blot和免疫沉淀分析（略）

1: 线粒体总蛋白加非还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品; 2: 使用正常小鼠血清从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到的蛋白加还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品; 3: 使用BGB095 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀得到的蛋白加还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品; 4: 线粒体总蛋白加还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备的蛋白样品.

图2 BGB095 mAb的Uni-ZAP XR表达文库筛选阳性克隆重组表达蛋白的Western blot鉴定（略）

1: 阳性克隆1; 2: 阳性克隆2.

2.4 BGB095 mAb的免疫组化和间接免疫荧光鉴定 免疫组化实验结果显示， 鼠抗人ECHS1 mAb识别的抗原定位于成人肝细胞胞质中; 间接免疫荧光实验进一步明确ECHS1 mAb识别的蛋白位于线粒体（图3、 4）。

图3 ECHS1 mAb的免疫组化鉴定(×400)（略）

A: 阴性对照 (正常小鼠血清); B: ECHS1 mAb BGB095.

图4 BGB095识别抗原的亚细胞器定位(×400)（略）

A: 线粒体特异性标记物罗丹明123（绿色荧光）; B: TRITC-羊抗小鼠IgG（红色荧光）; C: A和B的重叠图形， 所形成的黄色荧光提示ECHS1 mAb 识别的蛋白位于线粒体.

3 讨论

ECHS1是体内脂肪酸代谢和改造的关键酶， 在线粒体β-氧化中发挥着重要的作用。目前越来越多的研究表明， ECHS1不仅可以引起一系列代谢性疾病， 还与多种肿瘤的发生发展密切相关。ECHS1在基因结构上具有高度的保守性， 并与其他多种水解酶和异构酶如Δ2， Δ3-烯酰辅酶A异构酶和4-氯苯甲酰辅酶A去卤酶等在基因序列上具有相当高的一致性， 因而将其归为水解酶/异构酶超家族［6］。ECHS1单体的相对Mr为31000， 在天然状态下ECHS1以六聚体的形式存在， 其单体可与乙酰乙酰基辅酶A、 辛酰辅酶A和4-（N，N-二甲氨基）苯乙烯醛基辅酶A等酶类形成复合物［7］。我们在文库筛选过程中利用大肠杆菌系统重组表达了ECHS1， 通过Western blot鉴定其Mr为42000， 基于ECHS1的结构特点， 我们考虑该结果很可能与ECHS1体内酶复合作用有关， 对于这一问题的研究目前仍在进行之中。

我们制备的ECHS1 mAb可以应用于ELISA、 Western blot、 免疫沉淀、 免疫组化和间接免疫荧光等实验， 为进一步研究ECHS1在代谢和肿瘤中的作用、 ECHS1的结构特点以及水解酶/异构酶超家族的功能提供了有力的工具。

参考文献

［1］ Uwe J， Elizabeth D， Michelle L， et al. Human mitochondrial Enoyl-CoA hydratase gene (ECHS1): structural organization and assignment to chromosome 10q26.2-q26.3［J］. Genomics， 1997， 40(3): 470-475.

［2］ Hale E， Bennett J. Fatty acid oxidation disorders: A new class of metabolic diseases［J］. J Pediatr， 1992， 121(1): 1-11.

［3］ Lin JF， Xu J， Tian HY， et al. Identification of candidate prostate cancer biomarkers in prostate needle biopsy specimens using proteomic analysis［J］. Int J Cancer， 2007， 121(12): 2596-2605.

［4］ Yeh CS， Wang JY， Cheng TL， et al. Fatty acid metabolism pathway play an important role in carcinogenesis of human colorectal cancers by Microarray-Bioinformatics analysis［J］. Cancer Letters， 2006， 233(2): 297-308.

［5］ Gao JE， Gao Y， Ju YF， et al. Proteomics-based generation and characterization of monoclonal antibodies against human liver mitochondrial proteins［J］. Proteomics， 2006， 6(2): 427-437.

免疫室自我鉴定总结第2篇

关键词：抗核抗体；抗核抗体谱；自身免疫性疾病

近年来，随着临床对自身免疫性疾病的不断深入研究，抗核抗体和抗核抗体谱的检测越来越受到临床重视，自身免疫性疾病是抗体的自身免疫应答失控，免疫功能紊乱，反应过度造成机体的正常结构被相应的抗体作用后引起多系统器质性疾病及功能障碍。抗核抗体（ANA）是一组针对细胞核内的DNA、RNA、蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体，是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称，可用于多种自身免疫性疾病的筛查，随着免疫学的发展，抗核抗体（ANA）和抗核抗体谱的检测也应用于临床，成为了自身免疫性疾病的诊断与疗效观察必不可少的实验室指标[1]，本文对科室开展此项检测技术的1330例标本进行回顾性分析，并探讨联合检测抗核抗体（ANA）和抗核抗体（ANA）谱技术在该地区开展的意义，并分析其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 1330病例来自我院2013年1月～2014年7月门诊及住院患者（其中自身免疫性疾病外院及本院确诊者153例，系统性红斑狼疮（SLE）49例，干燥综合征（SS）27例，肌炎/皮肌炎（PM/DM）12例，混合性结缔组织病（MCTD）8例，系统性硬皮病（PSS）5例，类风湿关节炎（RA）42例，强直性脊柱炎（AS）3例，过敏性紫癜（AP）7例），所有患者均空腹采血3ml，2h内分离血清备用。

1.2方法 抗核抗体（ANA）检测试剂由德国欧蒙公司提供，抗核抗体（ANA）谱检测试剂由深圳亚辉龙生物科技有限公司提供，抗核抗体（ANA）谱的项目包括：抗双链DNA抗体（ds-DNA）、抗核小体抗体（Nucleosome）、抗组蛋白抗体（Histone）、抗史密斯抗体（Sm）、抗核糖体P蛋白抗体（Ribosomalp）、抗干燥综合征抗原A抗体（SS-A/R）、抗干燥综合征抗原B抗体（SS-B）、抗着丝点B蛋白抗体（CENP B）、抗硬皮病70抗体（SCL-70）、抗核糖体蛋白抗体（U1-SnRNP）、抗组氨酰tRNA合成酶抗体（J0-1）。抗核抗体（ANA）和抗双链DNA抗体（ds-DNA）采用间接免疫荧光（IIF）法、抗核抗体（ANA）以抗体滴度大于1：100为阳性；抗核抗体（ANA）谱采用免疫印迹法，荧光显微镜为重庆江南光学仪器设备厂的XSZ-HS7。

2 结果

2.11330例标本中，抗核抗体（ANA）阳性数为503例，阳性率为37.8%（503/1330），在该类标本中荧光模型最多的是颗粒型、其次是均质型，见表1。

2.2503例抗核抗体（ANA）阳性中，抗核抗体（ANA）谱阳性数为241例，阳性率为47.9%（241/503），在该类标本中，抗体阳性多呈现一联或二联为主，与之相应的荧光核型结果分布情况，见表2。

2.3在自身免疫性疾病中，抗核抗体（ANA）阳性率与荧光核型分布情况，见表3，在该类疾病中，抗核抗体（ANA）阳性率高。

3 讨论

抗核抗体（ANA）是以哺乳动物的细胞核成分为靶抗原的自身抗体总称，是自身免疫性疾病重要的血清学指标[2]，不同的自身免疫性疾病可产生不同的ANA抗体谱。在本文实验过程中，研究结果显示，ANA阳性率为37.8%（503/1330），与文献报道的39.9%相近[3]，表明用间接荧光法开展ANA的检测对该地区的自身免疫性疾病有重要筛查意义。

本实验结果显示出不同荧光核型的ANA与ANA谱抗体之间的关系有各自的特点，241例ANA谱阳性标本中56.8%是颗粒型，主要与抗SS-A/R0、抗Sm、抗Nucleosomes、抗U1-SnRNP有关；25.7%是均质型，主要与抗ds-DNA、抗J0-1、抗SS-A/R0、抗Sm有关；12.0%是核仁型，主要与抗SS-A/R0、抗U1-SnRNP有关；混合型/其它无显著的差别。虽然ANA和ANA谱抗体之间有一定的关系，但从表2中不难发现，不同的自身抗体可以呈现相同的荧光核型，同一种自身抗体可出现不同的荧光模型，它们之间没有绝对的规律可循，不能简单地通过荧光核型来分析判断相应的抗体类型，必须用间接荧光法筛查ANA，并联合ANA谱，才能大致确定ANA靶抗原的类型，从而有效提高对相应疾病的诊断与鉴别诊断。

在确诊的153例自身免疫性疾病中，ANA阳性率较高，反之，如果ANA或ANA谱出现阳性，从表3中显示，应该高度疑似自身免疫性疾病。ANA或ANA谱检测技术目前已在大医院广泛用于自身免疫性疾病的诊断和疗效观察。ANA无种属和器官特异性，在不同的自身免疫性疾病（AID）中可出现不同的组合，因此，ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中极为重要的实验，它对明确自身免疫性疾病（AID）诊断、临床分型、病情观察、治疗评价都具有重要意义[3]。

ANA或ANA谱检测技术在安岳地区的开展，有力地为临床提供了实验室依据，填补了该地区自身免疫性疾病实验室检测的空白，首次该地区自身免疫性疾病的诊断提供了特异性的检测方法，使临床上许多疑难症得以明确。自身免疫性疾病患者能够得到及时的诊断和治疗，为他们带来福音，同时还大大推动了该地区风湿病事业的发展，使该地区自身免疫性疾病的诊治水平跃上一个新的台阶与国内接轨。更重要的是，为进一步攻克自身免疫性疾病的诊治奠定了坚实基础，也标志着我院风湿病的诊治水平又上新台阶。实践了卫计委的"小病不出村、大病不出县、疑难病才上大医院"的医政方针，同时为病员节约了费用，减轻了经济负担。该技术设备简单、故障率低、操作技术难度不太强。目前，在县级医院开展的科室不多，希望通过本文的研究，能为基层医院领导或同行提供借鉴，共同把该项技术开展起来，践行我们卫生系统的"三好一满意"。

综上所述，开展ANA或ANA谱联合检测技术，不但利于患者，更加有利于临床诊断，而且对疾病的分型、疗效评估上具有较高的应用价值，值得推广。

参考文献：

[1]孙家祥.1725例血清抗核抗体及抗核抗体谱检测结果分析[J].西部医学，2012，24（3）：584-585.

免疫室自我鉴定总结第3篇

【关键词】乳腺浸润性导管癌；双向电泳；血清蛋白质组分析；相关抗原

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）04-0144-02

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目（2005-298）；贵州省科学技术基金项目（黔科合J字2007-2086）

乳腺浸润性导管癌是乳腺癌中最常见的一种类型，预后较差[1]。肿瘤相关抗原（TAA）是在肿瘤发生、发展过程中高表达的，能够诱发机体发生免疫应答的抗原。血清学蛋白质组分析（SERPA）是一种基于蛋白质组学和免疫学原理，利用二维电泳和质谱分析方法筛选和鉴定TAA的新技术[2]，目前已被广泛应用于肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病的研究中[3]，但其在乳腺浸润性导管癌研究中应用的报道尚少。我们采用SERPA方法对乳腺浸润性导管癌TAA进行了筛选，以期为该病的发生、发展机制研究及辅助诊断提供基础。

1材料

1.1标本来源

收集贵阳医学院附属医院2010年12月至2011年3月期间收治的20例女性乳腺浸润性导管癌患者（无其它自身免疫性疾病）的静脉血清作为实验组，所有病例取材得知情同意，采血和手术前未进行放疗、化疗和内分泌治疗，年龄范围34-78岁，平均年龄49.5岁；所有患者组织标本均经病理结果证实，按国际抗癌协会（UICC）制定的乳腺癌分期标准（TNM分期法）分为Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期7例。另外同期采集20例健康女性志愿者静脉血清作为对照组，年龄范围36-75岁，平均年龄52.8岁。健康志愿者均经系统健康体检，无乳腺相关疾病史、其它自身免疫性疾病和恶性肿瘤家族史。人乳腺浸润性导管癌细胞株T-47D细胞购自中国科学院细胞库。纳入本研究者采其空腹静脉血5ml，尽快分离血清并置-80℃冰箱保存。

1.2主要试剂

高糖DMEM培养基购于美国Gibco公司；IPG胶条（13cm，pH3-10）、裂解液购自Amershan biosciences公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG（HRP-兔抗人IgG）购自武汉博士德公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自美国Millpore公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

2 方法

2.1 细胞培养及总蛋白的制备

用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于5%CO2细胞培养箱中培养。收集对数生长期的细胞，加入5倍体积裂解液（7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，65mM DTT，0.2%Bio-Lyte）混匀，液氮中反复冻融3-4次（每次置液氮中3秒，室温融化），加入20ug/ml脱氧核糖核酸酶，离心1小时（4℃，20000×g），取上清即为细胞总蛋白。用Bradford法检测浓度，将样品分装并且置-80℃保存。

2.2 双向电泳和Western blot分析

取700μg T-47D全细胞蛋白进行2-DE，2-DE操作按照说明书进行。2-DE所得凝胶经考马斯亮蓝R-250染色液染色2h；并脱色至蛋白点清晰可见为止。

T-47D细胞总蛋白经双向电泳分离后，半干转印法转印至PVDF膜并封闭2h，分别与1：100稀释的乳腺浸润性导管癌或对照血清（一抗）于室温孵育2h，用TBST洗膜液洗膜（10min×3次）；其次与辣根过氧化物酶标记的兔抗人（1：3000）二抗室温孵育2h；再经TBST溶液洗膜（10min×3次）；最后经ECL化学发光检测得到胶片；观察杂交信号点，并确定发生免疫反应的蛋白在双向电泳凝胶上的位置。

2.3 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件，用X2检验对与患者血清和对照血清发生免疫反应的蛋白进行分析，p

2.4候选蛋白酶解和质谱鉴定

选取2-DE凝胶上候选蛋白质斑点经胰酶酶解，肽段经液相色谱串联质谱（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析，用Mascot搜索引擎搜索NCBInr数据库，获知氨基酸序列。

3 结果

3.1 T-47D细胞总蛋白2-DE分析

使用图像分析软件对T-47D细胞总蛋白双向电泳图谱进行分析，在分子量为14.4.0kDa-94kDa和等电点pI3.0-10.0的范围内，发现约630个蛋白质点（图1）。

3.2 T-47D细胞总蛋白与血清的Western blot分析和统计学分析

T-47D细胞总蛋白和对照血清发生免疫反应的蛋白较少，大约为4个蛋白点（图2）；而其与患者血清发生免疫反应的蛋白较多，大约14个蛋白点（图3）。采用SPSS17.0软件对与患者血清和对照血清发生免疫反应的蛋白进行统计学分析，筛选出10个差异蛋白（表1）。这10个差异蛋白分别与对照组（N）和实验组（BC）血清发生免疫反应印迹图（图4）；确定这10个差异蛋白在2-DE凝胶上的位置，其主要分布在分子量为22.0kDa-94kDa和等电点pI4.7-6.7的范围内（图5）。

4 讨论

分离鉴定TAA有可能发现新的辅助早期诊断、预后判断和疗效监测的候选肿瘤标志物。本研究运用SERPA方法对引起乳腺浸润性导管癌患者发生体液免疫反应的抗原进行检测并筛选出10个抗原，经质谱鉴定及数据搜索，鉴定出其中8个抗原的功能，主要涉及到分子伴侣、能量代谢、细胞信号；有两个抗原未鉴定出功能。HSP90、P4HB、ER-60、HSP60、HSP27属于分子伴侣蛋白，是原核和真核生物细胞在应激状态下可被诱导表达的一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族。多项国内外研究[4]显示，上述五种蛋白在乳腺癌患者体内表达升高，本研究结果与之一致。PGAM1是一种糖分解酶，主要在糖酵解过程中起作用，因而能促进癌细胞等糖酵解旺盛的细胞生存。研究发现，PGAM1在肺癌、肝癌和食管癌中表达明显升高，但在乳腺癌肿瘤抗原方面的研究罕见报道。因此，PGAM1在乳腺浸润性导管癌中的作用值得进一步探讨。EEF1G和P0属于信号类蛋白，其中EEF1G含有N-末端谷胱甘肽S转移酶域，可与氨基酰-tRNA结合，将其运至核糖体，使肽链延长；P0是一种多功能蛋白，参与翻译过程中的调节机制。有研究[5]发现，EEF1G和P0在乳腺癌组织中的表达明显升高，但P0表达升高或降低在病理、生理代谢中的具体作用目前尚未清楚，其在乳腺浸润性导管癌中的作用待于进一步研究。本研究中两个未鉴定出功能的蛋白是未命名蛋白和假想蛋白，其结构和功能还不清楚。

参考文献

[1]吴骥，管小青，顾书成等.COX一2及Ki67在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及临床意义[J].中国肿瘤外科杂志，2013，5（5）：296-299.

[2]Oaks M， Taylor S， Shaffer J. Autoantibodies targeting tumor-associated antigens in metastatic cancer[J].OncoImmunology， 2013， 2（6）， e24841.

[3] 李良宏.乳腺癌中HSP90和Caspase-3的表达及其与临床病理、预后的关系[J].疑难病杂志，2012，11（4）：271-273.

免疫室自我鉴定总结第4篇

【摘要】

目的: 构建人精子特异性乳酸脱氢酶 DNA疫苗， 并免疫雌雄两性BALB/c小鼠， 以观察特异性抗体的产生。方法: 采用分子克隆的方法构建pVAX1hLDHC DNA疫苗。双酶切及正反向测序对该DNA疫苗进行鉴定。肌肉注射方法免疫雌雄两性BALB/c小鼠， ELISA和Western blot方法检测小鼠血清中的特异性抗体， 常规病理学方法检测雄性实验小鼠的睾丸组织。结果: 双酶切及正反向测序结果表明: 插入片段的序列以及插入的位置和方向均正确。肌肉注射免疫BALB/c小鼠后可诱导明显的体液免疫反应， 且在雄性实验小鼠中未观察到睾丸炎的发生。结论: 成功构建了具有一定免疫效果的hLDHC DNA疫苗， 为今后进行更深入的研究奠定了基础。

【关键词】 精子特异性乳酸脱氢酶; DNA疫苗; 基因免疫

精子特异性乳酸脱氢酶即乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenase C4， LDHC4）是一种仅存在于鸟类和哺乳动物精子细胞中的乳酸脱氢酶同工酶， 其功能可能与精子的能量代谢和获能有关［1， 2］。鉴于分布上的特异性， LDHC4一直被当作免疫避孕疫苗的候选对象而受到重视［3］。核酸疫苗是继减毒疫苗、 基因工程疫苗之后的第3代疫苗; 与前两代疫苗相比， 具有很多明显优势， 可诱导机体同时产生细胞免疫和体液免疫、 应答持续时间长、 没有潜在致病危险等。本研究我们根据GenBank登陆的人LDHC4序列， 采用分子克隆的方法， 体外获得hLDHC4基因编码序列， 并将其与pVAX1表达载体连接， 构建了DNA疫苗pVAX1hLDHC， 并对其进行了鉴定。将此疫苗通过肌肉注射方法免疫雌雄两性BALB/c小鼠， 检测了小鼠血清中特异性抗体的产生。

1 材料和方法

1.1 材料 人睾丸λTripIEx cDNA文库为美国CLONTECH公司产品; pVAX1真核表达载体为Invitrogen公司产品; 兔网织红细胞体外转录/翻译试剂盒（TNT Quick Coupled Transcription/Translation System）为Promega公司产品; 质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品; 福氏佐剂购自Gibco公司; BALB/c小鼠48只， 雌雄各半， 6～8周龄， 清洁级， 购自中国科学院上海实验动物中心， 合格证号: SCXR（沪）2004-0005， 实验和饲养均在南京军区福州总医院动物实验科进行。

1.2 方法

1.2.1 人LDHC4 DNA疫苗的构建及鉴定 以人睾丸λTripIEx cDNA文库为模板， 依据GenBank登录的人LDHC4 mRNA（GI: 187065）全长序列， 设计引物。PCR扩增hLDHC4编码序列全长。上游引物为 5′CCGAAGCTTGCACCATGTCAACTGTCAAGGAGCAGC3′， 带一个HindⅢ酶切位点（下划线）， 下游引物为5′CCGCTCGAGTTAAAATATTAGATCCTTTTGAATATTCC3′， 带一个XholⅠ酶切位点（下划线）， 预期产物大小为1 016 bp。将其与真核表达载体pVAX1连接， 获得DNA疫苗pVAX1hLDHC， 转化入大肠杆菌E.coli DH5α中扩增。提取转化菌中的重组质粒， HindⅢ/XholⅠ双酶切分析插入片段的有无和大小， 将经双酶切鉴定的重组质粒委托上海博亚生物公司测序。以鉴定后的pVAX1hLDHC为模板， 采用兔网织红细胞体外转录/翻译试剂盒， 进行体外转录和翻译。反应体系为: TNT Quick Master Mix 40 μL 、 methionine 1 μL、 pVAX1hLDHC重组质粒4 μL （约2 μg）、 ddH2O 5 μL。混匀， 30℃反应90 min。

1.2.2 免疫用DNA疫苗的制备 使用碱裂解法与无内毒素质粒大量提取试剂盒相结合方法提取并纯化重组质粒。方法简述如下: 首先采用传统碱裂解法从1 000 mL过夜培养的转化菌中提取重组质粒， 室温下风干后， 按照试剂盒说明书的步骤重新抽提并纯化。在此过程中去除可能引起实验动物发热等一系列异常反应的内毒素。琼脂糖凝胶电泳以及分光光度法测定质粒的纯度和含量。

1.2.3 重组hLDHC4蛋白的制备 将体外获得的hLDHC4编码序列与原核表达载体pET28a(+)连接， 获得重组质粒pET28a（+）hLDHC， 转化入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）， IPTG诱导重组hLDHC4蛋白的可溶性表达， Ni+NTA亲和层析法（按His融合蛋白纯化试剂盒说明书所述方法进行）纯化重组蛋白， SDSPAGE电泳鉴定蛋白质纯度［4］。

1.2.4 BALB/c小鼠的基因免疫 BALB/c小鼠42只， 分为4组。 A组为重组蛋白疫苗组， 10只; B组为生理盐水组， 6只; C组为空质粒组， 6只; D组为DNA疫苗免疫组， 20只。每组雌雄各半。在戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg)状态下进行免疫。A组的免疫方式为: 将重组蛋白100 μL (60 μg)加等体积完全弗氏佐剂充分乳化， 于每只小鼠背部皮下分4点注射。4周后将重组蛋白100 μL (8 μg)与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化后， 腹腔注射作加强免疫， 4周后再次作加强免疫， 共免疫3次。C、 D组的免疫方式为: 将质粒（空质粒、 重组质粒）用生理盐水调整浓度为1 g/L。免疫前， 于小鼠双腿股四头肌注射5 g/L盐酸布吡卡因100 μL， 24 h后相同部位注射100 μg质粒。每隔3周加强免疫1次， 共免疫3次。B组用等体积生理盐水代替质粒溶液， 免疫方式同C、 D组。

1.2.5 小鼠血清中hLDHC4抗体的ELISA检测 每次免疫前均从小鼠眼眶后静脉采血0.1～0.3 mL。4℃过夜， 8 000 r/min离心10 min收集血清， -20℃保存备用。以30 mg/L重组蛋白为抗原， 50 μL/孔包被反应孔， 4℃过夜。50 μL (40 g/L)BSA封闭液37℃封闭1 h。将各组小鼠血清1∶200稀释后， 50 μL/孔加入到反应孔中， 37℃反应1 h， 加入1∶20 000稀释的羊抗鼠IgGBiotin 结合物， 37℃反应1 h， 加入50 μL 1∶50 000稀释的HRPStreptavidin， 37℃孵育1 h， 加入新鲜配制的四甲基联苯胺底物使用液50 μL， 37℃避光显色5～10 min。加50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应， 酶联免疫检测仪在主波长450 nm与次波长650 nm处测吸光度（A）值， 以确定各组血清中的抗体滴度。

包被缓冲液将重组蛋白作一系列稀释（10 mg/L至60 mg/L）后， 按上述方法进行ELISA检测， 小鼠血清使用DNA疫苗组免疫后6周的血清（1∶200稀释）， 以确定血清中的抗体与抗原的关系。

1.2.6 小鼠血清中hLDHC4抗体的Western blot检测 将制备的hLDHC4抗原经120 g/L SDSPAGE电泳后， 置Towbin转移缓冲液中平衡15 min， 15 V电压下转移30 min， 取出硝酸纤维素膜置10 g/L BSA中4℃封闭过夜， 加入1∶50稀释的免疫血清， 室温下反应1 h， 加入1∶20 000稀释的羊抗鼠IgGBiotin 结合物， 室温下反应1 h， 加入1∶1 000稀释的HRPStreptavidin， 室温下反应1 h， 加入4氯1萘酚显色液显色5～10 min。

1.2.7 小鼠睾丸组织常规病理检查 抽取2只ELISA检测阳性的雄性小鼠， 颈椎脱臼法处死， 摘取睾丸组织， 40 g/L多聚甲醛固定， 常规病理检查。

2 结果

2.1 hLDHC4 DNA疫苗的制备及鉴定 采用如上所述的PCR方法， 体外获得了hLDHC4编码序列， 将其与pVAX1表达载体连接后获得了重组质粒 pVAX1hLDHC 即DNA疫苗， HindⅢ/XholⅠ双酶切分析显示: 重组质粒可释放1条约1 000 bp的插入片段， 与预期大小一致（图1）; 正反向测序结果表明: 插入片段的序列和方向均正确。每次用于免疫动物的重组质粒经双酶切分析后均在1 000 bp位置出现一条插入片段， 且用分光光度法测定质粒的浓度和纯度时， A260/A280均在1.8左右， 无RNA或蛋白质等杂质污染。

2.2 小鼠血清的ELISA检测 以30 mg/L作为抗原包被浓度对各组小鼠血清进行ELISA检测。结果表明: DNA疫苗组和重组蛋白疫苗组的小鼠血清中的抗体随免疫次数的增加， 滴度逐渐升高。而生理盐水组和空质粒组的小鼠血清抗体滴度变化不明显（图2， 重组蛋白疫苗组因免疫时间不同， 图中未显示）。将包被抗原做一系列稀释后， 与1∶200稀释的DNA疫苗组的小鼠血清反应。结果显示， 抗原包被浓度在20 mg/L与50 mg/L之间时， 所测得的A450值随抗原浓度的增加而升高。

图1 重组质粒的双酶切分析（略）

M: DNA marker; 1: 重组质粒酶切前;

2: 重组质粒酶切后; 3: 空质粒酶切前;

4: 空质粒酶切后.

图2 各组小鼠血清中的抗体滴度随免疫次数的变化曲线（略）

2.3 免疫血清的Western blot检测 以重组蛋白hLDHC4为抗原检测小鼠血清中的hLDHC4抗体。结果显示: 重组蛋白疫苗组和DNA疫苗组的小鼠血清中含有的待测抗体， 在硝酸纤维素膜上形成特异性条带（图3）， 而生理盐水组和空质粒组的小鼠血清中均未检测到特异性抗体的存在。

图3 小鼠血清中hLDHC4抗体的Western blot检测（略）

A1: 重组蛋白疫苗组雌性实验小鼠; B1: 重组蛋白疫苗组雄性实验小鼠; C1: DNA疫苗组雌性实验小鼠; D1: DNA疫苗组雄性实验小鼠; A2 和 C2: 空质粒免疫组雌性实验小鼠; B2 和 D2: 空质粒免疫组雄性实验小鼠.

2.4 病理检测 常规病理检测结果显示， 雄性实验小鼠的睾丸组织精小管大小正常， 无萎缩、 无基底膜增厚等现象， 无灶状或弥漫性淋巴细胞和浆细胞浸润以及与上述相似的炎症细胞浸润现象。

3 讨论

DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接转移到动物体内， 通过宿主表达系统合成抗原蛋白， 诱导宿主产生免疫应答， 以达到预防和治疗疾病的目的， 目前已在多种疾病的防治研究中显示出巨大的应用潜力［5， 6］。使用DNA疫苗技术进行抗生育研究也取得了突破性进展［7， 8］。在本研究中， 首先采用分子克隆的方法体外获得了hLDHC4编码序列， 并构建了pVAX1hLDHC DNA疫苗。pVAX1是经美国FDA批准的专门用来发展DNA疫苗的载体， 与其他载体相比， 它整合到人染色体中的几率最低。双酶切分析及正反向测序结果均表明: hLDHC4的编码序列已成功插入到pVAX1表达载体中， 且插入片段的序列以及插入的位置和方向均正确。兔网织红细胞体外表达系统可快速鉴定蛋白质的表达。使用该系统鉴定pVAX1hLDHC DNA疫苗的表达活性， 结果表明: 该DNA疫苗在此系统中可指导hLDHC4蛋白表达， 提示此重组质粒在哺乳细胞表达系统中具有指导hLDHC4蛋白合成的功能。以上结果说明本研究已成功构建了hLDHC4的DNA疫苗， 可进行后续实验。

我们使用国内外比较公认的肌肉注射途径进行免疫。免疫前24 h用5 g/L盐酸布吡卡因预处理待注射部位， 使肌肉处于再生状态， 这种再生状态的肌肉组织对DNA的吸收增加， 抗原表达量增高， 可刺激机体产生较高水平的抗体［9］。ELISA检测结果表明， pVAX1hLDHC DNA疫苗免疫BALB/c小鼠后， 可诱导小鼠产生明显的体液免疫应答。第1次免疫后3周， 在雌、 雄实验小鼠中均检测到抗体的产生， 此后滴度随免疫次数的增加而升高。生理盐水组和pVAX1空质粒组均未检测到抗体产生。Western blot检测结果也表明， DNA疫苗和重组蛋白疫苗在小鼠体内诱导产生的抗体具有很高的特异性， 与纯化的hLDHC4蛋白抗原反应后， 可形成特异性的条带。由于 LDHC4对于雄性动物是一种自身抗原， 可诱导自身免疫反应的发生。我们在ELISA检测阳性的雄性实验小鼠中未观察到由于自身免疫反应而引起的睾丸炎现象， 可能是血睾屏障的作用， 这说明pVAX1hLDHC DNA疫苗具有一定的安全性。

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免疫室自我鉴定总结第5篇

关键词：后疫情时代；法医鉴定；面临问题；对策

一、新冠肺炎疫情概述

自2019年12月以来，β-冠状病毒新亚型—2019新型冠状病毒（简称新冠病毒）感染流行，引发新冠肺炎，被世卫组织命名为COVID-19。本次新冠肺炎疫情席卷全球，范围之广，传染性之强，较以往的SARS疫情更为强烈。目前我国整体上疫情得到了有效控制，但在局部地区仍然有零散爆发点。截止至2022年1月9日，全世界范围已确诊新冠肺炎病例超过3．04亿，死亡人数超过540万［1］．新冠肺炎对人民的生命健康造成了严重的威胁和影响。疫情初期，对于因新冠肺炎而死亡的病例，因无系统尸体解剖，故无法提供完整的新冠肺炎病理学资料，无法明确判定其发病机理、器官损害等问题。尸体解剖是一项不可忽视的重要科学手段，其对于传染性疫情疾病的研究和诊断具有重要的指导意义，并且对于探究传染性疫情疾病的病因、发病机制、临床诊疗、科学研究、医学教育等也必不可少。如今医学科学与医疗技术现代化迅猛发展，且病理诊断是疾病确诊的金标准，故绝不能忽视病理解剖。因此，由法医病理学和相关临床病理学等领域的专家，对新冠病毒感染致死病人的尸体进行系统的解剖非常有必要。丛斌院士向中国工程院提交了关于对新冠病毒感染致死病人尸体解剖检验的建议，并随后提交了新冠肺炎病死尸体病理解剖的工作方案［2］。2020年2月16日，刘良教授及其团队在国家政策许可的条件下，在武汉金银潭医院完成首例和第2例COVID-19死亡尸体的系统解剖［3］。通过系统的尸体解剖促进完善病理学研究，才能更好地研究COVID-19的临床病理转归及其发病机制，为进一步完善新冠肺炎感染者的治疗方案提供参考。

二、后疫情时代法医鉴定面临问题及对策建议

（一）关于法医病理学鉴定

21世纪以来，我国经历了SARS以及新冠肺炎两次大规模的冠状病毒感染引起的呼吸系统传染病。法医和病理专业人员在研究传染病发病机制中起到了至关重要的作用，尤其在本次新冠肺炎疫情中。新冠肺炎的潜伏期可达2周，甚至更久，传染性比较强，而且存在无症状感染者或潜伏期患者的传染现象。对于感染新冠病毒的死者，冷藏条件保存的，可能会使新冠病毒的存活时间延长。由于法医学死亡原因鉴定的需要，法医病理学鉴定人员工作中会接触新冠病毒感染、无症状感染相关死者的尸体或组织器官的检验鉴定工作。同时，不仅仅是本次疫情问题，今后涉及其他传染病法医病理鉴定也应同时引起重视。法医病理学鉴定人员工作实践中，需要严格执行科学的防护工作，确保公共安全并有效控制疾病传播。人员相关问题。新冠病毒可以通过多种途径传播，比如气溶胶、呼吸道飞沫或者接触染有病毒的媒介，其他多种传染病也有类似的传播途径。参与传染病尸体检验鉴定的人员，解剖应在规定条件下进行。首先，要对尸解进行风险评估分析，比如对传染病诊断、解剖的必要性、解剖方法的选择等内容进行综合评估。其次，解剖前的更衣、淋浴、防护用具的选择和佩戴也至关重要。防护用具包括但不限于护目镜、口罩、防护帽、防护面罩、防渗透防护服、外科手术手套等。防护用具的类型选择、规格要求等需要与传染病的等级类型相适应，绝不能低于相关文件规定的最低要求。防护用具的穿戴和脱卸要严格按照清洁污染情况，按照一定的顺序执行。最后，建议参与鉴定人员需具备丰富的解剖工作经验，并具有副高级以上职称。总之，鉴定人员应至少具有安全意识、健全的尸体解剖技术操作规程，以及职业暴露的应急预案。仪器设备问题。解剖器械应便于消毒和清洁，容易拆洗，使用后的解剖器械要及时对其进行消毒灭菌，然后密封保存。解剖台应便于清洗消毒。组织病理取材应在设有生物安全柜等专用抽气设备的取材台上进行操作。尸体器官问题。大体器官，要按中华人民共和国卫生部令第45号，进行分类包装和运输。把大体器官放入防漏防水的内层容器，外层包装防止压坏变形使用硬质包装。运输链的全程需要专人监控，做到人不离物，物不离人，中间做好交接工作并且全程严禁打开。鉴定标准问题。目前关于传染病尸体法医病理解剖的相关规定还不完善，大部分都是借用其他部门的相关文件执行。比如传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定、新型冠状病毒感染的肺炎患者遗体处置工作指引（试行）等等，而法医病理学司法鉴定直接相关的标准目前只有（GA/T830-2009）尸体解剖检验室建设规范、（GA/T147-2019）法医学尸体检验技术总则、（GA/T148-2019）法医病理学检材的提取、固定、取材及保存规范。对于严重的传染病，法医尸体解剖以及病理实验室的具体规定缺乏操作性，需要主管部门出台具体的标准规定。解剖环境问题。由于种种原因，目前我国大多数法医病理鉴定机构解剖室条件简陋，设备设施不完善。根据不同的传染病等级类型，生物防护等级也应相对应。解剖室应与其他区域完全隔离，并具有符合规定的通风系统，防止传染性病毒病菌释放到外部环境。解剖室还需划分为五个区域，即清洁区域、一级缓冲区域、半污染区域、二级缓冲区域、污染区域。另外，建议设置传染病尸体专用运送通道。根据解剖需要，可以使清洁区域设置为正压状态，半污染区域设置为常压状态，污染区域设置为负压状态。把具有传染性的气溶胶控制在相应规定区域内，防止污染扩散。污染的空气应经过滤器过滤后才能排出。凡是在解剖室使用过的解剖器械，以及排出的废物及废水，必须经过严格的消毒灭菌处理。洗手、洗眼、喷淋设施应俱全，排水系统应尽可能快速排出，同时避免回流。解剖结束后，应对解剖室、解剖台进行消毒，可采用含氯消毒液、75％酒精溶液、过氧化氢消毒液擦拭，同时可采用紫外消毒灯消毒。

（二）关于法医临床相关鉴定

在新冠肺炎疫情防控期间以及延续期间，司法鉴定实践中会受理关于人身损害等的伤残及损伤程度评定案件。损伤及伤残评定相关标准中，对于涉及肺功能的相关条款需要关注。鉴定管理方面。基于疫情防控的需要，业务主管部门或联合其他部门应出台特殊时期法医临床学鉴定流程相关文件，包括疫情防控期间以及复工后职业防护等问题，不仅仅是用于本次疫情，亦可以用于后期类似传染病暴发时期的鉴定工作预案。在疫情严重爆发期间，人员管控可能导致已受理的案件无法正常鉴定，那么这里我们就需要根据国家相关法律法规来正确执行，避免不必要的纠纷，合理解决实际问题。鉴定过程方面。委托案件后可以使用网络、电话等方式与伤者以及家属进行沟通，充分了解与鉴定相关信息，避免直接接触。鉴定材料可以使用邮寄，并对邮件进行消杀，目前人民法院已使用网上司法鉴定委托系统进行委托鉴定，网上办公能够更好地避免人员接触。如案件必须当面交流，尤其是法医临床查体不可避免时，配备好防护物品，按照相应的传染病等级进行防护，规划操作流程，测量体温、查验健康码以及核酸阴性检测报告都可根据具体情况进行，并做好完善的登记，以便出现突发状况时能够快速准确地溯源。同时鉴定环境的消杀和口罩、手套等废弃物的处理也应符合相关规定。鉴定标准方面。对于劳动能力鉴定职工工伤与职业病致残等级和人体损伤致残程度分级鉴定标准，关于肺功能伤残评定的条款都有涉及。而人体损伤程度鉴定标准和人身保险伤残评定两个鉴定标准中，未见涉及肺功能条款。在司法鉴定实践中，被鉴定人可能因无法理解容易引发纠纷，所以标准制定部门可以随着标准使用情况进行合理修订。在疫情暴发以及延续期间，另一个重要问题就是引发的医疗损害鉴定，也是我们需要重点关注的关键点。在这个疫情暴发的特殊时期，医务工作者有着极大的感染风险，承担着超负荷工作压力。那么当判定医疗过错时，在评判注意义务的问题上，应当充分分析各种影响因素，比如医疗风险增加、诊治难度大、医疗资源不足，鉴定人员在评价医方需要遵守的义务时，应谨慎判断医方存在过错，避免过严教条主义，从而体现对医方的尊重。

（三）关于法医毒物学鉴定和法医物证学鉴定

对于法医物证和法医毒物鉴定项目，在涉及人体的鉴定项目中，两者有共同之处，就是以生物检材为鉴定对象。对于检材的发现、提取、包装与送检等环节要严格按照规范操作，及时并尽早提取检材，加强监测生物检材的污染情况。根据生物检材后续的检验鉴定分析目的不同，比如有的检材用于毒物分析鉴定，有的用于DNA个体识别分析，宜采用不同的消毒方法，避免误判或者检测目标物毁损灭失。现场提取生物检材时，如个体有新冠病毒感染可能，应将检材采取相应的消毒方法消毒以后再提取。鉴定案件实践中，现场可能有待发现和提取的，各种与案件有关的检材，比如微量生物物证检材，若消毒时使用Peraceticacid、含氯消毒液或紫外线长时间照射，均会导致DNA损伤或破坏，进而影响微量生物检材DNA的检出率［4-5］。若法医毒物鉴定分析的目标物是上述消毒液成分，而现场提取之前恰巧又使用上述消毒液消毒，那么对鉴定结果势必会造成影响，得出假阳性结果，或者导致待测目标物实际检测浓度升高，实践中务必要引起重视。法医物证鉴定实验室消毒普遍使用75%酒精溶液，可以消毒杀菌同时不破坏DNA。所以司法实践中提取现场生物检材，可综合使用紫外线短时间照射与75%酒精溶液，来对现场环境进行消毒。另外，在提取现场生物检材后，在检材的包装袋外面，最好加装一次性密封包装，建议在外部包装上喷洒75%酒精溶液消毒。且需要在检材包装袋上的标签别注明。目前，国内大多数法医物证鉴定实验室和法医毒物鉴定实验室，因各种原因无法达到国家规定的相应生物安全等级。实验室在受理案件时应询问具体情况，包括传染病情况、提取的检材的消毒情况等，以做好受理案件和案件检验时的防护工作，以及调整和甄别检验方法，后期合理解释检测结果与鉴定意见。中间产物、废弃物以及留存检材应安全妥善保存，若确定无须长期保存的需要进行无害化处理。检验检测完成后，应对实验室的器械与环境进行彻底的消毒灭菌。现行的相关标准如GAT1162-2014法医生物检材的提取、保存及送检规范，对于涉及传染病死者的案件生物检材，相关规定不全面且内容很少。针对传染病死者的生物检材，现有标准缺乏具体操作性和针对性，不能有效实施，希望标准制定部门能够及时地完善补充，更好地有利于后期鉴定实践。

三、展望

新冠肺炎等传染病疫情，对社会各个领域的影响是严重且多方面的。法医学是解决社会纷争和矛盾的证据类科学，在传染病疫情领域法医科学技术发挥了不可替代的作用。法医学专业技术人员在工作实践中，面临传染病感染的高度危险。面对类似本次新冠肺炎病毒的疫情，法医鉴定机构和鉴定人，应当高度重视传染病暴露风险，并采取必要的防范应对措施。面对疫情法医鉴定人员，要迎难而上，积极主动地打好新冠肺炎疫情防控战。鉴定人员要有效规范地做好疫情防控期间的尸体检验鉴定、活体检验鉴定，及生物检材的检验鉴定工作。希望各法医鉴定机构和鉴定人在加强传染病暴露风险有关的鉴定理论和实务工作方面开展深入研究。面对新冠肺炎疫情的突然来袭，法医鉴定人员在工作中也面临一些困境，即往日常检案实践中，极少涉及传染病尸体。国内多数法医病理鉴定机构在解剖室建设中，极少数能满足甲类传染病尸检，司法鉴定CMA资质认定或CNAS认可过程中，对传染病尸检的相应实操细则缺失。但愿此次新冠肺炎疫情，能敲响警钟，希望相关部门能重视起来，补充完善相关标准或规范。希望鉴定机构加大投入，加强实验室的功能分区和仪器设备等硬件建设，做好法医鉴定人员的健康防护。

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免疫室自我鉴定总结第6篇

【关键词】 重组基因;，EGFRvIII;，HBcAg;，原核表达;，免疫原性

Construction and prokaryotic expression of recombinant gene EGFRvIIIHBcAg and immunogenicity analysis of the fusion protein

[Abstract] AIM: To construct recombinant prokaryotic expression plasmid pET28a(+)/cPEP3c and evaluate the immunogenicity of the fusion protein. METHODS: cDNA fragment encoding PEP3 was obtained from pGEMT Easy/PEP3 and inserted into recombinant plasmid pGEMEX/HBcAg. Then it was subcloned in prokaryotic expression vector and transformed into E.coli BL21(DE3). The fusion protein was expressed by inducing IPTG and purified by Ni2+NTA affinity chromatography. BALB/c mice were immunized with fusion protein and the antibody titre was determined by indirect ELISA. RESULTS: The recombinant gene was confirmed to be correct by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. After prokaryotic expression， fusion protein existed in sediment and accounted for 56% of all bacterial lysate. The purified product accounted for 92% of all protein and its concentration was 8 g/L. The antibody titre in blood serum reached 1∶16000 after the fourth immunization and reached 1∶2.56×105 after the sixth immunization. The titre of antiPEP3 antibody reached 1∶1.28×105 and the titre of antiHBcAg antibody was less than 1∶4×103. CONCLUSION: Fusion gene PEP3HBcAg is highly expressed in E.coli BL21. The expressed fusion protein can induce neutralizing antibody with high titer and specificity， which lays a foundation for the study of genetically engineering vaccine for malignant tumors with the high expression of EGFRvIII.

[Keywords]recombinant gene; the epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII; hepatitis B core antigen(HBcAg); prokaryotic expression; immunogenicity

[摘 要] 目的: 构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒， 进行原核表达、 纯化， 观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法: 通过双酶切从pGEMT Easy/PEP3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段， 插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中， 获得重组质粒pGEMEX/cPEP3c， 将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中， 通过IPTG诱导蛋白表达， 利用Ni2+NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化; 用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠， 用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。 结果: 经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a(+)载体中， 融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%， 纯化产物占总蛋白的92%， 浓度约8 g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后， 其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000， 第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶256×105， 抗PEP3抗体滴度达到1∶128×105， 抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论: 融合基因PEP3HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达， 表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体， 从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。

[关键词]重组基因; EGFRvIII; HBcAg; 原核表达; 免疫原性

表皮生长因子受体III型突变体(epidermal growth factor receptor variant III， EGFRvIII)在多种恶性肿瘤中高表达， 它与肿瘤的发生、 发展有密切关系。由于EGFRvIII仅存在于恶性肿瘤组织， 为治疗肿瘤提供了高选择性靶点， 为了探索针对EGFRvIII的基因工程疫苗，本研究在前期成功克隆编码EGFRvIII突变区PEP3抗原表位cDNA的基础上， 将编码PEP3的cDNA片段与去除了主要免疫优势区（MIR）的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)进行基因融合， 构建原核表达质粒pET28a(+)/cPEP3c， 进行原核表达和纯化， 并对表达出的融合蛋白进行免疫原性分析， 从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 重组质粒pGEMT Easy/PEP3由本实验室构建[1]; pET28a(+)质粒、 删除了HBcAg MIR区的重组质粒pGEMEX/HBcAg、 E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)、 完全弗氏佐剂、 不完全弗氏佐剂等试剂由西安华广生物工程公司提供; 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购自华美生物公司; PEP3多肽由西安蓝晶生物科技有限公司合成; Ni2+NTA His亲和层析蛋白纯化柱为Novagen公司产品; BALB/c小鼠（雌性， 6～8周龄， 质量15～20 g）购自本校医学院实验动物中心。DNA测序由上海基康生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 构建重组质粒pGEMEX/cPEP3c 用BamH I和Xho I双酶切重组质粒pGEMT Easy/PEP3及pGEMEX/HBcAg， 回收和纯化目的基因， 用T4 DNA连接酶连接载体pGEMEX/HBcAg和目的基因， 转化感受态E.coli DH5α， 挑选单菌落摇菌， 提质粒， EcoR I/Xho I酶切鉴定， 得到重组质粒命名为pGEMEX/cPEP3c。

1.2.2 构建表达质粒pET28a(+)/cPEP3c 用EcoR I和Sal I对重组质粒pGEMEX/cPEP3c和pET28a(+)进行双酶切， 回收和纯化目的片段， 进行DNA连接， 转化E.coli DH5α感受态细胞， 用Kana+培养基筛选阳性克隆， 小提质粒进行酶切鉴定并测序， 对筛选出的正确的重组质粒进行大量制备。

1.2.3 重组质粒pET28a(+)/cPEP3c的原核表达 用重组质粒pET28a(+)/cPEP3c转化E.coli BL21(DE3)受体菌， 同时用空质粒pET28a(+)转化BL21菌作对照。分别挑取单个阳性菌落接种入5 mL LB培养液中， 37℃振摇培养至培养液的A600达0.4～0.6。各取2 mL培养菌液加入200 mL Kana+的LB培养液中， 振摇培养3 h， 然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L， 继续振摇培养8 h， 诱导蛋白表达。

1.2.4 原核表达蛋白的分离和纯化 收集细菌用裂解缓冲液和超声细胞粉碎机裂解细菌， 分别收集上清和沉淀进行SDSPAGE分析， 考马斯亮蓝染色， 观察蛋白表达。将沉淀（包涵体）充分溶解于8 mol/L尿素中， 室温16 h， 收集上清， 在含复性液的透析袋中透析48 h， 收集上清即为复性后的表达蛋白。Ni2+NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化， 操作步骤按Novagen公司纯化手册的说明书进行， 120 g/L SDSPAGE分析、 考马斯亮蓝染色， 通过凝胶扫描分析融合蛋白表达水平， 对照标准蛋白曲线， 确定融合蛋白浓度。

1.2.5 免疫动物 BALB/c小鼠11只， 于腹腔注射融合蛋白100 μL/只， 每周免疫1次， 第1次使用完全弗氏佐剂与等量融合蛋白的乳化混合物， 第2次使用不完全弗氏佐剂与等量融合蛋白的乳化混合物， 此后免疫不加佐剂而仅使用融合蛋白， 连续免疫7次。分别于初次免疫前和2次免疫后每周剪鼠尾取血。

1.2.6 间接ELISA法检测血清抗体滴度 用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释融合蛋白至5

mg/L， 包被96孔培养板， 每孔100 μL， PBS洗涤后， 加入1～11号小鼠不同稀释倍数的免疫后血清（从1∶1000开始倍比稀释）， 37℃孵育1 h， 再次洗涤后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶6000)， 37℃孵育1 h， TMB显色10 min， 2 mol/L H2SO4终止反应， 酶标仪记录每孔A值， P/N>2.1为阳性标准。

1.2.7 间接ELISA法检测表达蛋白的抗原特异性 制备PEP3合成肽和HBcAg包被液， 一抗为不同稀释度的免疫后血清（从1∶1000开始倍比稀释）， 二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶6000)， TMB显色10 min， 酶标仪记录每孔A600值， P/N>2.1为阳性标准。

2 结果

2.1 重组质粒pGEMEX/cPEP3c的构建与鉴定 将连接得到的重组质粒pGEMEX/cPEP3c经双酶切鉴定， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示在39 bp处可见一明显条带， 与PEP3长度一致(图1)。用DNASIS2.5软件分析可见融合的基因片段处于同一读码框内， 表明重组质粒构建成功。

图1 重组质粒pGEMEX/cPEP3c酶切鉴定　略

2.2 表达质粒pET28a(+)/cPEP3c的构建和鉴定 将EcoR I/Sal I双酶切后的pET28a(+)大片段和pGEMEX/cPEP3c小片段进行连接， 对连接产物用EcoR I/Sal I双酶切， 可切出5414 bp和484 bp两个片段， 与预测结果相吻合， 表明融合基因已插入pET28a(+)载体中（图2）; 应用DNASIS分析软件将融合基因序列与GenBank所提供的基因序列比较， 结果显示融合基因序列与设计序列完全一致。

图2 重组质粒pET28a(+)/cPEP3c酶切鉴定　略

2.3 重组质粒pET28a(+)/cPEP3c原核表达 重组质粒诱导表达后表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中， 在相对分子质量（Mr）为11500 处可见目的条带（图3）， 表达量占沉淀全菌蛋白的56%。表达蛋白经亲和层析柱纯化后， 纯化产物占总蛋白的92%， 浓度约8 g/L(图4)。

图3 融合基因诱导表达后的SDSPAGE 分析　略

2.4 间接ELISA法检测血清抗体滴度 免疫第3周有9只小鼠血清可检测到抗体， 免疫第5周所有小鼠血清中均可检测到抗体， 免疫第7周所有小鼠血清中抗体滴度均超过1∶1×105(表1)， 总体抗体滴度从第4周开始迅速上升， 至第6周基本稳定（图4）。

2.5 表达蛋白的抗原性检测 经过3次免疫， 仅有3只小鼠血清中可检测到抗PEP3抗体， 检测不到抗HBc抗体， 继续强化免疫3次后， 有10只鼠免疫血清抗PEP3抗体滴度达到1∶1.28×105， 抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。

表1 间接ELISA法检测血清抗体滴度　略

图4 免疫血清抗体滴度变化趋势　略

3 讨论

近年来， 随着分子肿瘤学的发展， 发现了某些与肿瘤发生、 发展密切相关的受体蛋白， 由于它们高表达于肿瘤细胞， 从而为肿瘤治疗提供了理想靶点， EGFRvIII就是其中一种。研究证实， 针对EGFRvIII的抗体、 小分子信号传导抑制剂、 特异性核酶等均显示出良好的抗肿瘤效应[2-4]。肿瘤疫苗一直是肿瘤学和免疫学领域研究的热点， 它能够重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力， 防止肿瘤细胞的入侵， 杀伤和清除体内肿瘤细胞， 并使机体产生有效而持久的免疫力， 因此对肿瘤的预防和控制具有积极作用。近年来针对肿瘤特异性抗原表位的疫苗多集中在合成肽疫苗方面， 研究表明[5]， 针对EGFRvIII突变融合区的PEP3多肽耦联槭血兰蛋白（PEP3KLH）免疫动物可诱导机体产生细胞和体液免疫， 抑制高表达EGFRvIII的肿瘤细胞的增殖、 防止细胞恶性变、 延长生存时间。然而， 合成肽对技术设备要求很高， 费用昂贵， 不能工业化生产， 从而限制了其普及应用。为了制备针对EGFRvIII基因工程疫苗， 本实验室在前期克隆了编码PEP3的cDNA片段[1]， 由于这一cDNA片段仅包含了39个碱基对， 其免疫原性弱， 在体内易被蛋白水解酶降解， 所以不适合直接作为抗原使用， 常需要和其他大分子基因(作为载体)进行融合以增强其免疫原性和在体内的稳定性。HBcAg是最常用的基因工程融合肽疫苗载体， 它不但可在细菌中高效表达并自我装配成病毒样颗粒， 而且具有很强的抗原性和免疫原性， 在人和动物中均可引起较强的免疫应答[6]。当外源基因与HBcAg的适当部位融合时， 可使外源表位暴露于病毒样颗粒的表面， 并增加其抗原性或免疫原性。HBcAg分子的刺突顶端MIR是外源性表位插入最理想的部位， 其插入的容量非常大， 外源表位插入后不但能最大限度地增强免疫原性， 而且能去除固有的HBc抗原性和免疫原性[7]。本研究室曾将β淀粉样肽基因插入HBcAg基因的MIR部位， 经原核表达获得的融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性[8]。基于此， 我们采用基因工程技术将编码PEP3 cDNA与删除了MIR区的HBcAg进行基因融合， 通过原核表达成功获得了PEP3和HBcAg的融合蛋白， 此融合蛋白能诱导机体产生显著的体液免疫， 产生高效价抗体， 进一步研究显示血清中抗体主要针对PEP3抗原表位， 抗HBcAg抗体滴度很低， 说明该融合蛋白在保持核心样颗粒结构的同时PEP3抗原表位得以暴露， 从而产生高效价的抗PEP3特异性抗体， 由于PEP3抗原表位代替了乙肝核心抗原的免疫显性区， 使HBcAg的抗原性显著下降。以上结果表明， 通过基因工程方法制备的重组融合蛋白作为肿瘤疫苗可诱导抗EGFRvIII特异性抗体的产生， 为下一步通过动物实验研究此疫苗的抗肿瘤效应奠定了基础。

参考文献

[1] 段小艺， 王健生， 刘 敏， 等. 编码表皮生长因子受体III型突变体PEP3表位的cDNA的克隆[J]. 西安交通大学学报（医学版）， 2006， 27(2): 140-142.

[2] Montgomery RB. Antagonistic and agon istic effects of quinazoline tyrosine kinase inhibitors on mutant EGF receptor function[J]. Int J Cancer， 2002， 101(2): 111-117.

[3] Sampson JH， Crotty LE， Lee S， et al. Unarmed， tumorspecific monoclonal antibody effectively treats brain tumors[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97(13): 7503-7508.

[4] Luo X， Gong X， Tang CK. Suppression of EGFRvIIImediated proliferation and tumorigenesis of breast cancer cells by ribozyme[J]. Int J Cancer， 2003， 104(6): 716-721.

[5] Heimberger AB， Crotty LE， Archer GE， et al. Epidermal growth factor receptor VIII peptide vaccination is efficacious against established intracerebral tumors[J]. Clin Cancer Res， 2003， 9(11): 4247-4254.

[6] Milich DR， Chen M， Schodel F， et al. Role of B cells in antigen presentation of the hepatitis B core[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94(26): 14648-14653.

免疫室自我鉴定总结第7篇

【摘要】

目的: 制备抗CMTM4的多肽抗体并鉴定其性能。方法: 通过TMHMM、 DNAStar等软件对CMTM4的3种剪接体， CMTM4v1， v2和v3的蛋白序列进行分析， 选取了4段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素（KLH）偶联。其中第1、 2、 3条多肽为3种剪接体共有， 混合后免疫家兔， 制备Ab1; 而第4条多肽为CMTM4v1所特有， 单独免疫家兔， 制备Ab2。ELISA法检测抗体效价。免疫亲和层析法纯化后， 进行Western blot和免疫组织化学检测， 鉴定这2种抗体的特异性与适用范围。结果: 得到兔抗人CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2， 效价分别达1∶105和1∶106。纯化后的Ab1用于Western blot可特异识别超表达的CMTM4v1和v2， 并可用于免疫组织化学实验; 而Ab2仅可用于Western blot， 特异性识别超表达的CMTM4v1。Ab1还可特异识别小鼠内源性Cmtm4。结论: 用多肽免疫家兔制备的2种抗CMTM4抗体不仅具有较高的效价以及特异性， 并且Ab1还可以特异识别小鼠Cmtm4， 为CMTM4的功能研究提供了有力的支持。

【关键词】 CMTM4 多肽抗体 免疫亲和纯化

[Abstract] AIM: To prepare， purify and characterize the polyclonal antibodies against CMTM4. METHODS: Four polypeptides named peptide 1， 2， 3， and 4 were synthesized based on the bioinformatics analysis of the three isoforms of CMTM4， CMTM4v1， v2， and v3， and coupled with keyhole limpet hemocyanin (KLH) for immunization. Among them， peptide 1， 2， and 3， common for CMTM4v1， v2， and v3， were mixed for immunization to prepare the antibody which can recognize all of the three isoforms (Ab1); while peptide 4， which is specific for CMTM4v1， was injected separately into New Zealand rabbits to prepare the antibody specifically targeting CMTM4v1 (Ab2). ELISA assay was used to detect the titers of the antibodies. After purification by immunoaffinity chromatography， Ab1 and Ab2 were identified by Western blot and immunohistochemistry assays. RESULTS: The titers of Ab1 and Ab2 were 1∶105 and 1∶106， respectively. Western blot confirmed their high specificity. Ab1 could also be used for immunohistochemistry analysis， but Ab2 could not. Immunohistochemistry analysis with Ab1 demonstrated the high expression level of CMTM4 in human testis， which was consistent with the previous result of Northern blot. Moreover， Western blot and immunohistochemistry analysis verified that Ab1 can also recognize mouse Cmtm4. CONCLUSION: Two specific antibodies against human CMTM4 were obtained， which will be helpful for further study.

[Keywords]CMTM4; Antipeptide antibody; Immunoaffinity chromatography purification

趋化素样因子（chemokinelike factor， CKLF）和趋化素样因子超家族成员18（chemokinelike factor superfamily member 18， CKLFSF18）是本研究室在国际上首次报道的一个新基因家族， 其编码产物的结构和功能特点介于经典的趋化因子与4次跨膜蛋白之间[1， 2]。由于该家族大部分成员存在不同剪接体， 且每个基因至少有一种剪接体的编码产物具有MARVEL结构域， 因此， 2005年12月， CKLFSF18被国际人类基因命名委员会（HUGO）重新命名为CMTM18（CKLFlike MARVEL transmembrane domain containing member 18）。

CMTM4有3种剪接体， CMTM4v1、 v2和v3， 分别编码234、 208和179个氨基酸; 其中CMTM4v1和v2是主要形式， 在多种组织中广泛表达; 而CMTM4v3仅存在于部分肾脏组织和胎盘组织中。CMTM4v2是该基因全长cDNA产物; 目前， 在小鼠中仅发现了Cmtm4v2（简称小鼠Cmtm4）， 其氨基酸序列与人CMTM4v2同源性高达95.7%。CMTM4v1蛋白羧基端比v2多26个氨基酸。为了进一步研究CMTM4的生物学功能， 我们设计了CMTM4多肽， 免疫家兔， 制备多肽抗体; 通过免疫亲和层析方法， 对其进行纯化; 利用Western blot和免疫组织化学等实验鉴定其特异性与适用范围。

1 材料和方法

1.1 材料 新西兰家兔与C57BL/6N小鼠购自北京大学医学部动物中心。溴化氰（CNBr）活化的Sepharose 4B和硝酸纤维素膜（NC）购自Amersham Pharmacia biotech公司; 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司; IRDyetTM偶联的二抗购自LICOR BIOSCIENCE公司。弗氏佐剂购自Sigma公司。正常羊血清工作液、 真核细胞表达载体pcDNA3.1/MycHisB()购自Invitrogen公司; 真核细胞表达质粒pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v1和pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v2为本实验室构建。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析及CMTM4多肽的设计 利用TMHMM（cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）软件分析CMTM4蛋白跨膜区; 利用DNAstar软件包(DNASTAR Inc.， Madison， WI， USA)进行多序列比对以及CMTM4的抗原性、 亲疏水性及表面暴露性预测[3]。综合考虑上述因素以及CMTM4的3种剪接体的序列特点， 选取CMTM4蛋白中4段氨基酸序列（命名为peptide1、 2、 3、 4。其中1、 2、 3为3种剪接体共有; 4为CMTM4v1特有）， 在蛋白质数据库中验证其特异性后， 委托杭州中肽公司进行多肽合成以及KLH偶联。

1.2.2 CMTM4多肽抗体的制备 将与KLH偶联的peptide1、 2、 3等质量混合后免疫家兔， 制备可以识别全部3种剪接体的多肽抗体（Ab1）; 偶联KLH的peptide 4单独免疫家兔， 制备特异针对CMTM4v1的抗体（Ab2）。初次免疫将300 μg的peptide 1、 2、 3混合多肽以及100 μg的peptide 4分别用PBS稀释至1 mL后与等体积的完全弗氏佐剂充分混合， 于两足蹠部各0.25 mL皮下注射， 其余后背部皮下多点（6点）注射。之后每2周加强免疫1次， 使用同样剂量多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合后， 全部后背部皮下多点（8点）注射[4]。第2次加强免疫后14 d取兔耳缘静脉血样检测效价， 至效价达1∶105以上后， 将家兔处死， 心脏取血获取血清。

1.2.3 CMTM4多肽抗体效价测定 将CMTM4裸肽稀释至1 mg/L包被ELISA酶标板， 100 μL/孔， 10 g/L BSA 37℃封闭2 h。PBST（PBS+0.5 mL/L Tween20）洗涤3次后， 加入不同稀释度（1∶104， 1∶105， 1∶5×105， 1∶106）的免疫前后兔血清， 100 μL/孔， 37℃孵育2 h。彻底洗涤后加入HRP标记的羊抗兔二抗（1∶5000）， 37℃孵育1 h后洗涤， 加入TMB底物室温避光显色15 min， 加入2 mol/L H2SO4终止反应， 使用酶标仪测定A490值， 高于免疫前血清10倍为阳性。

1.2.4 CMTM4多肽抗体亲和纯化 首先将peptide 1、 2和3裸肽各3 mg的混合物以及peptide 4裸肽4 mg分别与CNBr活化的Sepharose 4B偶联， 制备多肽亲和层析柱。PBS冲洗并平衡柱料后， 分别加入PBS稀释的相应的免疫后血清4℃旋转孵育过夜。PBS冲洗柱料后使用pH2.4、 0.1 mol/L甘氨酸缓冲液洗脱。收集洗脱液， 立即用1/20体积的1 mol/L TrisHCl (pH9.0)中和并透析至PBS中。BCA法定量， SDSPAGE电泳鉴定抗体纯度。

1.2.5 CMTM4多肽抗体特异性和适用范围的鉴定 （1）Western blot检测: 用电穿孔法将真核细胞表达质粒pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1、 pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v2以及空载体对照pcDNA3.1/MycHisB(-)分别转染至HeLa细胞（2 mm电转杯， 120 v， 20 ms）。48 h后用RIPA裂解液（50 mmol/L TrisHCl pH7.5， 150 mmol/L NaCl， 1 mL/L NP40， 5 g/L脱氧胆酸钠， 1 g/L SDS）裂解细胞。将细胞裂解物与SDS蛋白上样缓冲液混合煮沸10 min， 离心取上清进行125 g/L SDSPAGE电泳。湿式法电转至NC膜上。50 g/L脱脂奶粉（TBST配制）室温封闭1 h， 分别加入纯化后的CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2（1∶200， 封闭液稀释）， 于4℃过夜反应; TBST（TBS+1 mL/L Tween20）洗涤3次后， 加入IRDyetTM800标记的抗兔二抗， 室温作用1 h; 彻底洗涤后， 用LICOR红外成像系统 (Odyssey， Lincoln， NE)检测信号。（2）CMTM4在人睾丸组织中表达情况的检测: 人睾丸组织取材后多聚甲醛固定， 常规石蜡包埋切片。切片经过脱蜡， 梯度酒精水化， 30 mL/L H2O2室温避光孵育10 min去除内源性过氧化物酶， 在柠檬酸钠缓冲液中煮沸进行抗原修复， 正常羊血清工作液室温封闭10 min， 然后分别滴加CMTM4多肽抗体Ab1（1∶50， PBS稀释）和Ab2（1∶10）， 4℃过夜反应。同样浓度的正常兔IgG作为阴性对照。PBS充分洗涤后滴加HRP标记的羊抗兔二抗室温反应30 min， PBS洗涤3次， DAB显色， 苏木精复染， 梯度酒精脱水， 最后中型树胶封片于显微镜下观察并记录结果。（3）免疫组织化学检测超表达的CMTM4: 将pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1和pcDNA3.1/MycHisB(-)空载体分别电转HeLa细胞， 48 h后胰酶消化细胞， PBS洗涤细胞2次后进行甩片， 每点3×104～10×104细胞， 经丙酮固定后， 进行免疫组化实验。经PBS洗涤， 去除内源性过氧化物酶， 和正常羊血清工作液封闭后， 按照上述免疫组化的方法依次与一抗、 二抗进行孵育， 并显色及观察结果。

1.2.6 CMTM4多肽抗体对小鼠内源性Cmtm4蛋白的识别 取C57BL/6N小鼠睾丸组织， 常规方法提取总蛋白及制作石蜡切片， 分别通过Western blot和免疫组化， 检测CMTM4多肽抗体Ab1对于小鼠内源性Cmtm4的线性表位和构象表位的识别情况。

2 结果

2.1 CMTM4的生物信息学分析 首先比较CMTM4v1、 v2和v3的氨基酸序列， 并分析其蛋白质序列和结构特征。人CMTM4v2是全长cDNA的编码产物， 编码208个氨基酸; 经过不同种属氨基酸序列的比对， 发现其在进化过程中非常保守， 在低等生物(例如: 鸡等)以及高等生物(小鼠、 大鼠)中均可发现其同源物， 且保守性很高， 小鼠与人的同源性为95.7%。CMTM4v1编码234个氨基酸， 羧基端比v2多26个氨基酸。同CMTM家族的其他成员一样， 生物信息学分析显示CMTM4v1和v2均含有MARVEL结构域和潜在的4次跨膜结构（图1）。利用DNAStar软件对CMTM4v1蛋白质的一级结构进行进一步分析， 综合考虑疏水性、 抗原性和表面暴露性等因素（图2）， 选取了表1所示的序列合成4条多肽用以制备抗体， 分别命名为peptide 1、 2、 3、 4。其中peptide 1、 2、 3为CMTM4v1和v2所共有， 并且在人与小鼠仅差一个氨基酸; 而peptide 4为CMTM4v1特有。

图1 人CMTM4v1跨膜区分析（略）

Fig 1 Putative transmembrane regions analysis of human CMTM4v1

图2 人CMTM4v1亲水性、 抗原性和表面暴露性分析（略）

Fig 2 Bioinformatics analysis of human CMTM4v1 on its hydrophilicity， antigenic index， and surface probability

表1 用于CMTM4抗体制备的4条多肽序列（略）

Tab 1 Peptides used for the preparation of the antiCMTM4 polyclonal antibodies

2.2 多肽抗体的制备和效价 Peptide 1、 2、 3、 4的合成及KLH偶联由杭州中肽公司完成， 纯度分别为81.3%、 82.6%、 84.3%和96.1%。免疫3次后取兔耳缘静脉血样， ELISA检测抗体效价， 二者分别达到1∶105和1∶106。处死家兔获取血清后对其进行免疫亲和纯化。SDSPAGE电泳显示抗体纯度较高（结果未显示）。

2.3 Western blot检测多肽抗体的特异性 在HeLa细胞中超表达CMTM4v1和v2， 将细胞裂解液通过SDSPAGE电泳分离后转移至NC膜上， 分别用Ab1和Ab2进行检测。结果显示Ab1能够特异性识别超表达的CMTM4v1和v2蛋白; 而Ab2仅能识别CMTM4v1， 不能检测到CMTM4v2（图3）。

图3 Western blot鉴定CMTM4多肽抗体特异性（略）

Fig 3 The specificity of the antiCMTM4 polyclonal antibodies Ab1 and Ab2 verified by Western blot

A: Ab1 group; B: Ab2 group. 1: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-); 2: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1; 3: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v2.

2.4 免疫组织化学检测CMTM4在男性生殖系统中的表达 由于生物信息学分析以及之前的研究结果都提示CMTM4在男性生殖系统高表达， 于是使用Ab1和Ab2通过免疫组织化学的方法检测了CMTM4在正常人睾丸组织中的表达情况。如图4所示， Ab1可以在正常人睾丸组织中检测到CMTM4有较高的表达， 与之前Northern blot的结果一致[1]， 并且在生精细胞中有明显的核定位; 但Ab2则无法检测到阳性信号。这提示Ab2不能用于免疫组化研究。

图4 免疫组织化学检测CMTM4在正常人睾丸组织中的表达（略）

Fig 4 The expression of CMTM4 detected by immunohistochemistry (×400)

A: Normal rabbit IgG control; B: Ab1 group; C: Ab2 group.

2.5 多肽抗体识别抗原构象表位的能力 免疫组化检测表明， Ab1能特异识别HeLa细胞中超表达的CMTM4v1蛋白， 但Ab2不能识别（图5）。这进一步证实Ab1能够识别抗原构象表位， 可应用于免疫组织化学研究; 而Ab2不适用。

2.6 CMTM4多肽抗体Ab1对小鼠Cmtm4的识别 由于制备抗体Ab1所使用人CMTM4的3条多肽与小鼠Cmtm4仅相差1个氨基酸， 所以理论上Ab1也可识别小鼠Cmtm4。Western blot显示， Ab1在小鼠睾丸组织蛋白中可检测到两条特异的带， Mr分别为72000和40000（图6A）。免疫组织化学实验也表明（图6B）， 该抗体同样可以特异地识别天然构象的小鼠Cmtm4。

图5 免疫组织化学鉴定CMTM4多肽抗体识别抗原构象表位的能力（略）

Fig 5 The competence of the antiCMTM4 antibodies Ab1 and Ab2 to recognize the conformational epitopes verified by the immunocytochemistry assay (×400)

A， B: Ab1 group; C， D: Ab2 group. A， C: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-); B， D: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1.

图6 CMTM4多肽抗体Ab1可识别小鼠Cmtm4（略）

Fig 6 AntiCMTM4 antibody Ab1 can recognize mouse Cmtm4 (×400)

A: Western blot. 1: Normal rabbit IgG control; 2: Ab1 group. B: Immunohistochemistry. 1: Normal rabbit IgG control; 2: Ab1 group.

3 讨论

由于蛋白质空间结构的复杂性， 为了提高抗体对靶蛋白的识别效率和特异性， 我们采取了将多条多肽混合免疫家兔的方法。为了增加小分子多肽的免疫原性， 我们设计多肽时在其C端加一个半胱氨酸（多肽序列中已有半胱氨酸的除外）， 用于与载体蛋白KLH偶联。此外， 一般认为， 多肽设计的长度应为10～20个氨基酸， 过短会使产生的抗体亲和力低下， 而过长则会导致合成纯化困难。但本研究中所设计的peptide2和3均达到甚至超过了30个氨基酸， 实践证明， 仍可获得纯度较高的多肽进而制备出高质量的抗体。

抗体的效价、 与抗原结合的特异性以及亲和力是判断其质量的标准。通过ELISA、 Western blot和免疫组织化学实验， 我们发现CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2都具有较高的效价， 并且都能够特异识别相应靶蛋白的线性表位。此外， Ab1还能够识别天然构象的内源性蛋白， 用于免疫组化实验， 为进一步研究CMTM4的组织表达谱和细胞内定位提供了有效的手段; Ab2虽不能用于免疫组化的检测， 但其用于Western blot可以特异识别CMTM4v1， 这对研究CMTM4不同剪切体蛋白质的功能有很大的帮助。二者对于蛋白构象表位识别能力的差异， 也体现了制备抗体时用多条多肽混合免疫的优越性。另外由于小鼠Cmtm4与人CMTM4同源性极高， 所设计多肽区仅有一个氨基酸不同， Western blot和免疫组化实验证实， Ab1也能够识别小鼠Cmtm4。小鼠Cmtm4的预期Mr为23000， 但Western blot结果提示小鼠Cmtm4在睾丸组织中有2种形式， Mr分别为72000和40000左右。由于人CMTM4v2和小鼠Cmtm4均具有亮氨酸拉链结构， 而具有亮氨酸拉链结构的分子通常以二聚体或多聚体形式存在[5]。因此， Mr 72000和40000可能是Cmtm4的多聚体或二聚体形式， 也可能存在其他形式的修饰。

总之， 通过设计合成多肽来快速制备抗体为新基因功能研究提供了很好的方法。按照此方法， 我们成功地获得了CMTM家族所有成员的多肽抗体， 为该家族基因的功能和机制研究提供了一定的实验基础。

参考文献

[1] Han WL， Ding PG， Ma DL， et al. Identification of eight genes encoding chemokinelike factor super family members 18(CKLFSF18) by in silico cloning and experimental validation[J]. Genomics， 2003， 81(6): 609-617.

[2] Han WL， Lou YX， Tang JM， et al. Molecular cloning and characterization of chemokinelike factor 1 (CKLF1)， a novel human cytokine with unique structure and potential chemotactic activity[J]. Biochem J， 2001， 357: 127-135.

[3] 臧林泉， 邱鹏新， 肖 茹， 等. YZ22蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(2): 205-207.

免疫室自我鉴定总结第8篇

结论 临沂市AFP监测系统保持高度敏感性，有能力及时发现各类监测病例。

［关键词］ 急性弛缓性麻痹；脊髓灰质炎；监测系统

［中图分类号］ R512.4［文献标识码］ A［文章编号］ 1672-4208(2008)01-0006-02

Evaluation of acute flaccid paralysis cases surveillance system during 2003～2006 in Linyi city LI Xiao，Linyi City Center forDisease Control and Prevention，Linyi 276001,China

【Abstract】 Objective To evaluate the operating quality of Acute Flaccid Paralysis(AFP)case surveillance system since the plan about nation to maintain nonpolio condition has appraised in Linyi.

Methods Analyze the date of AFP cases reported by AFP surveillance system of Linyi city by EpiData software.

Results During 2003-2006，202 AFP cases were reported in Linyi City，no wild poliovirus was detected.These AFP cases were distributed in 12 countries.The age of AFP cases was mainly 0-5 years old，accounting for 83.2%，higher incidence in male than in female，the rate is 1.93:1.All AFP cases were discarded poliomyelitis cases by the diagnoses group of Shandong Province.The rate of Guillain-Barre Syndrome(GBS)in these cases was 19.9% Monitored and has appraised 3 cases of VAPP.The reported incidence of non-polio AFP cases of children under 15 years old has been over 1/100000 since 2003.Other indexes have been above 80%.

Conclusion The AFP surveillance system of Linyi maintains high sensitivity has ability to discover all monitor case promptly.

【Key words】 Acute Flaccid Paralysis(AFP)；Poliomyelitis；Surveillancesystem

2000年10月29日，WHO西太平洋区宣布实现了无脊灰目标 [1] 。为维持我国无脊髓灰质炎状态，巩固实现消灭脊髓灰质炎工作取得的阶段性成果，卫生部于2003年制定并下发了《2003～2010年全国保持无脊髓灰质炎状态行动计划》，进一步完善AFP监测系统，维持高水平的流行病学监测和实验室监测工作质量，对于及时发现脊灰野病毒输入和疫苗衍生病毒循环，提高计划免疫工作薄弱等高危地区的监测工作质量具有重要意义。临沂市于1994年建立了急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测系统，为总结经验，发现监测工作中存在的问题，巩固无脊灰成果，现将2003～2006年AFP病例监测情况分析评价如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源 AFP病例监测数据来源于各县(市、区)上报的AFP病例个案调查表、随访表;病毒分离结果由山东省疾病预防控制中心脊髓灰质炎实验室提供;人口资料来源于各县(市、区)历年上报的人口资料。

1.2 统计方法 所有数据均由EpiData软件处理。

2 结果

2.1 AFP病例流行病学特征

2.1.1 地区分布 2003～2006年全市共报告AFP病例202例，未发现脊灰野病毒引起的病例。病例分布在全市12个县(市、区)，详见表1。

2.1.2 年龄、性别分布 202例AFP病例中，发病年龄最小为2个月，最大为14岁，主要为5岁以下儿童，共168 例，占83.2%。男性133例，占65.84%，女性69例，占34.16%，男女比例为1.93:1。

2.1.3 病例免疫史 202例AFP病例中，服苗

2.1.4 病原学监测结果 202例AFP病例粪便标本中分离到脊灰病毒(PV)的有12例，阳性率为5.94%，其中Ⅰ型1株、Ⅱ型8株、Ⅲ型5株（存在混合株）。PV株经国家脊灰实验室鉴定均为疫苗相关株。

2.1.5 病例最终分类 按病毒学分类标准，202例AFP病例均为排除脊灰病例，无脊灰确认病例。排除病例临床诊断为:格林巴利综合征48例，占23.76%；周期性麻痹18例，占8.91%；创伤性神经炎20例，占9.90%；短暂性肢体麻痹15例，占7.43%；疫苗相关病例（VAPP）3例，占1.49%，其余为非脊灰肠道病毒感染、多神经病、神经根炎、单神经炎、肌病、急性多发性肌炎、单瘫，累计98例，占48.51%。

2.2 就诊与报告 202例AFP病例的报告单位中乡镇医院3例，占1.49%，县级医院（防疫站）99例，占49.01%，地级75例，占37.13%，上级反馈25例，占12.38%。

2.3 2003年以来AFP病例监测指标完成情况 见表2。

3 讨论

脊髓灰质炎是继全球消灭天花之后，世界卫生组织提出的必须限期消灭的第二种危害人类健康的急性传染病。为了确保如期实现消灭脊灰的目标，临沂市在认真抓好脊灰疫苗(OPV)常规免疫的基础上，开展了多轮强化免疫工作，提高了人群免疫水平，从1994年以来未发现有脊灰野毒株引起的脊灰病例。在WHO的6个区中，目前只有美洲区、西太平洋区和欧洲区实现了无脊灰目标。与我国和西太平洋区接壤的一些国家仍然存在脊灰野病毒的传播，脊灰野病毒随时有传入我国的危险，近几年，我国也发现了脊灰病毒疫苗衍生株导致的病例[2]。因此，在实现无脊灰目标后，保持高水平OPV免疫接种率和高质量的AFP病例监测系统有着十分重要的意义。临沂市自1994年底建立AFP病例监测系统，经过多次业务培训，监测系统逐步完善。自建立AFP病例监测系统以来，15岁以下儿童非脊灰AFP病例报告发病率连续保持>1/10万。自2003～2006年，其余指标均达到了80%。报告的202例病例中，乡、县、市级医院均有病例报告，省级医院也有反馈，显示临沂市AFP病例监测系统网络健全，监测系统敏感。

从报告的AFP病例的OPV免疫情况分析，尚有5例零剂次免疫儿童，其中3例属流动儿童。提示要进一步加强计划免疫管理，提高并保持高的OPV免疫覆盖率，特别是对边远地区及流动儿童。从年龄分布看，发病集中于小年龄组，说明小年龄组儿童是监测的重点人群。从病例报告医疗单位看，乡镇医院仅3例，占 1.49%，提示今后仍不能忽视对基层临床医生的培训，特别是乡村医生，提高他们的病例报告意识有利于进一步提高监测系统的敏感性，以便及时监测并发现和处理新发病例。

近几年来，疫苗相关病例越来越受到各方关注，尤其是疫苗衍生变异株（VDPV）、cVDPV等问题对消灭脊灰工作的影响日趋严重，临沂市也陆续监测并鉴定了数例脊灰相关病例；同时鉴于各级疾病控制机构检测、检验设备和人员素质的提高，建议有关部门加强地市级脊灰实验室建设工作，提高监测检验速度和能力，将初筛检测实验室下移到地市级实验室，以便及时发现相关病毒，为疫情处理赢得更多的时间，减少病毒的扩散几率。同时非脊灰肠道病毒(NPEV)致瘫痪病例对消灭脊灰工作的影响也不容忽视，在病毒分离中占AFP病例病毒分离数的较大比例[3]。

为了继续维持临沂市的“无脊灰状态”，必须依据《2003～2010年全国保持无脊髓灰质炎状态行动计划》继续开展好以下工作:保持高水平的常规免疫接种率，不能放松AFP监测工作，保持已建立起的监测系统的高敏感性，以高度的责任心防范脊灰疫情死灰复燃并最终消灭这一危害人类数千年的传染病。

参 考 文 献

[1] 迮文远.计划免疫学[M].第2版.上海:上海科学技术文献出版社，2001:346-347.

[2]罗耀星.免疫预防与疾病控制[M].广东:广东科技出版社，2001:210-211.

免疫室自我鉴定总结第9篇

【关键词】 小鼠OCILrP2;，原核表达;，抗OCILrP2抗血清

[摘 要] 目的: 在原核系统中表达破骨细胞抑制凝集素家族成员之一OCILrP2基因， 并制备大鼠抗OCILrP2的抗血清。方法: 应用RTPCR从小鼠脾细胞中克隆的部分OCILrP2 cDNA， 构建重组表达载体pET28aOCILrP2， 并转化大肠杆菌BL21(DE3)， 以IPTG诱导表达HisOCILrP2融合蛋白。以表达产物免疫SD大鼠， 制备大鼠抗OCILrP2的抗血清。采用Western blot测定其效价和特异性。结果: RTPCR法扩增出235 bp的OCILrP2基因， 其cDNA序列与GenBank中登录的序列一致。以构建的重组质粒pET28aOCILrP2转化大肠杆菌获得目的蛋白的高表达。以表达的HisOCILrP2融合蛋白免疫大鼠获得抗小鼠OCILrP2的抗血清。Western blot分析表明， 该抗血清均可与原核表达的HisOCILrP2融合蛋白和真核表达的OCILrP2Ig融合蛋白特异性结合; 抗血清的效价为1∶2000。结论: 在原核细胞中表达了小鼠的OCILrP2蛋白， 制备了大鼠抗小鼠OCILrP2的抗血清， 为进一步研究OCILrP2的生物学功能奠定了基础。

[关键词]小鼠OCILrP2; 原核表达; 抗OCILrP2抗血清

破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2（osteoclast inhibitory lectinrelated protein 2， OCILrP2）是破骨细胞抑制凝集素（OCIL）家族的成员之一， 属于Ⅱ型跨膜糖蛋白， 具有1个较小的胞内区， 胞外区含有1个C型凝集素结构域。小鼠OCILrP2基因位于6号染色体的NK基因复合体内。此复合体存在很多C型凝集素相关基因， 包括CD69、 NKG2家族及Ly49家族及NKRP1家族等。OCIL家族包括OCIL(Clrb)、 OCILrP1(Clrd)和OCILrP2(Clrg)3个基因， 其胞外区具有很高的同源性(约80%)[1]。OCILrP2主要在免疫系统中表达， 其中在B细胞和树突状细胞（DC）中呈高表达; 在未活化的CD4+和CD8+ T细胞中有微量表达， 但T细胞活化后， 其表达上调。最近发现， OCILrP2为NK细胞受体蛋白1（NKRP1）家族成员中NKRP1F的配体[2]。研究表明， OCILrP2也可作为T细胞的共刺激分子， 在T细胞的活化过程中起作用[3， 4]。因此， 需要进一步研究OCILrP2在T细胞中的作用机制， 在B细胞、 DC中可能的功能， 以及其与NKRP1F相结合后对NK细胞功能的影响。本研究中用RTPCR克隆并在原核细胞中表达OCILrP2基因， 以表达的蛋白为免疫原制备大鼠抗OCILrP2的抗血清， 为进一步研究OCILrP2的功能提供了重要的试剂。

1 材料和方法

1.1 材料 Trizol试剂为Invitrogen公司产品。RTPCR试剂盒、 EcoRⅠ、 XhoⅠ和T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。质粒提取试剂盒、 DNA胶回收试剂盒为博大泰克公司产品。弗氏完全与不完全佐剂购自欣经科公司。HRP化学发光底物为Pierce公司产品。HRP标记的羊抗大鼠IgG为Sigma公司产品。蛋白marker购自华美公司。DNA marker购自鼎国公司。C57/B6小鼠及SD大鼠购自维通利华公司。原核表达载体pET28a及E.coli BL21（DE3）由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 小鼠OCILrP2基因的克隆及重组表达载体的构建 以C57/B6小鼠脾细胞中提取的总RNA为模板， 用Oligo4进行逆转录反应合成cDNA第1条链， 再以上游引物（P1）5′AAAGAATTCTGGAAGTGGACAAACAACAC3′（含EcoRⅠ酶切位点）和下游引物（P2）5′AATCTCGAGGACCATAGGGGAAAAAGTAG3′（含XhoⅠ酶切位点）进行， PCR扩增OcilrP2的部分cDNA。回收PCR产物（约为250 bp）， 用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后， 连接到表达质粒pET28a中的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间， 构建重组质粒pET28aOcilrP2。以重组质粒经转化大肠杆菌BL21（DE3）后， 提取重组质粒， 经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后， 送上海博亚公司测序。

1.2.2 重组HisOCILrP2融合蛋白的诱导表达 在3 mL含卡那霉素的LB培养基中， 接种转化菌鉴定正确的单个菌落， 于37℃振荡培养10 h， 再按1∶100的体积接种于10 mL含卡那霉素的YT培养基中， 于37℃、 摇菌培养至A600=0.6～0.8。加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L， 于37℃诱导8 h。收集菌体， 用PBS混悬后， 进行超声裂解， 离心裂解液， 收集上清和沉淀（沉淀用PBS混悬）。将上清和沉淀均加蛋白上样缓冲液煮沸5 min， 以未经IPTG诱导的转化菌作为对照， 进行SDSPAGE。

1.2.3 大鼠抗小鼠OCILrP2蛋白抗血清的制备 SDSPAGE后， 切取含有HisOCILrP2融合蛋白的凝胶条。将此胶条于PBS中研碎后免疫SD大鼠， 初次免疫用弗氏完全佐剂， 抗原量约为200

μg/只， 于腹线两侧皮下多点注射。3周后， 加强免疫， 抗原量同首次， 加弗氏不完全佐剂， 以后每隔2周加强免疫1次， 共免疫4次。最后1次免疫后7 d， 由颈动脉取血， 分离血清冻存于-20℃中。

1.2.4 抗血清效价及特异性的Western blot 检测 将分离的抗血清按1∶200、 1∶500、 1∶1000、 1∶2000系列稀释后， 进行Western blot检测抗血清的效价。将菌体总蛋白和本实验室制备的真核表达的OCILrP2Ig融合蛋白同时进行SDSPAGE后， 将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。依次滴加系列稀释的大鼠抗血清（过夜孵育， 洗涤）及1∶2500 HRP标记的羊抗大鼠IgG(孵育2 h， 洗涤)， 最后滴加HRP化学发光底物， 用ChemilmagerTM4400凝胶成像仪检测发光信号。

2 结果

2.1 小鼠OCILrP2基因的克隆 以P1和P2为引物， 以小鼠脾细胞中提取的总RNA为模板， 经RTPCR扩增出约250 bp的特异性基因片段， 大小同预计结果相符（图1）。

图1 OCILrP2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析　略

2.2 重组表达载体pET28aOCILrP2的构建 构建的pET28aOCILrP2经EcoR I和Xho I双酶切后， 可得到1条约为250 bp的片段（图2）。DNA测序结果与GenBank中登录的序列完全一致。

图2 重组质粒pET28aOCILrP2的酶切鉴定　略

2.3 HisOCILrP2融合蛋白的表达及鉴定 将含重组质粒的菌株经诱导和未经诱导8 h后， 收获菌体， 进行SDSPAGE分析。诱导菌出现相对分子质量（Mr）约为10000的1条带， 未诱导菌中没有此条带（图3）。采用抗His・Tag的抗体进行Western blot检测， 在相当于目的蛋白的Mr处出现1条特异性的带（结果未显示）。

图3 IPTG诱导HisOCILrP2融合蛋白表达的SDSPAGE分析　略

2.4 大鼠抗OCILrP2抗血清的制备与鉴定 大鼠经4次免疫后， 用Western blot检测抗血清的效价和特异性。结果显示， 在相当于HisOCILrP2融合蛋白的Mr处出现1条特异性的带; 而未免疫大鼠的血清则不与目的蛋白结合。抗血清的效价达1∶2000。进一步用本实验室制备的真核表达的OCILrP2Ig融合蛋白进行Western blot检测， 抗血清也能与真核表达的OCILrP2Ig融合蛋白特异性结合， 表明我们所制备的抗血清有较高的活性和特异性（图4）。

图4 OCILrP2抗血清的效价和Western blot的特异性分析　略

3 讨论

OCILrP2基因编码221个氨基酸， 包括141个氨基酸的胞外区、 21个氨基酸的跨膜区以及59个氨基酸的胞内区， 其中胞外区含有由113个氨基酸残基构成的C型凝集素结构域。OCILrP2可能在维持T细胞反应和记忆功能中起作用[3， 4]。OCILrP2与其配体NKRP1F的基因都在NKC区内， 这种受体与其配体属于同一超家族， 并且紧密连锁是极为罕见的， 可能有利于受体和其相应配体的共遗传， 并提示NKRP1和OCIL家族可能在免疫系统中具有重要的功能[2， 5]。为了进一步研究OCILrP2的功能， 我们通过比较小鼠OCIL家族的3个成员（mOCIL、 mOCILrp1和mOCILrp2）的同源性， 克隆了OCILrP2基因胞外区同源性低的区域， 构建了重组表达载体pET28aOCILrP2， 并在大肠杆菌中表达了融合蛋白HisOcilrp2。用表达的蛋白免疫SD大鼠获得了能与OCILrP2特异性结合的抗血清， 为进一步研究OCILrP2的功能提供了工具。

参考文献

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