微生物培养的方法第1篇

微生物检验培养基质量的好坏、配制使用和保存是否正确等直接影响到检测结果的准确性。现就微生物检验培养基的质量控制方法浅谈如下：

1　培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，避免阳光直射。开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在6个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。

2　培养基的制备

称量时要用专用的角匙，避免交叉污染。复水时不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长。含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟：加热培养基时一定要进行搅拌。为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热。一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，通常是121℃ 15min；含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH值，应在25℃温度下采用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。灭菌以后的培养基应该迅速冷却至所需温度并妥善保存。

3　培养基的性能测试

3.1　外观控制：制备好的培养基应有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化，是否蒸发/脱水。

3.2　污染控制：从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试(无菌试验)，确定无微生物生长方可使用。

3.3　性能测试

3.3.1　测试菌株：选择测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株，应来自国际/国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株，菌株的选择参考卫生行业标准WS/T232-2002《商业性微生物培养基质量检验规程》。

3.3.2　定量测试方法：常用改良Miles-Misra法。测试菌株、过夜培养物10倍递增稀释；测试平板和参照平板划分为4个区域并标记；从最高稀释度开始，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域；将稀释液涂满整个1/4区域，37℃培养18h；对易计数的区域计数，按公式计算生长率(生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数/参考培养基平板上获得的菌落总数)。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7，选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1。

3.3.3　半定量测试方法：常用改进的划线法接种法。平板分AB-CD四区，共划16条线，平行线大概相隔0.5cm，每条有菌落生长的划线记作1分，每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分，没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分，分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制，目标菌的生长指数G大于6时，培养基可接受。

3.3.4　定性测试方法：常用平板接种观察法。用接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养，目标菌应呈现良好生长，并有典型的菌落外观、大小和形态，非目标菌应是微弱生长或无生长。

总之，做好微生物检验培养基的质量控制是保证结果准确的基础和关键。

微生物培养的方法第2篇

关键词 微生物分离 选择

1 教材分析与课时安排

“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”是人教版高中生物（选修1）专题2“微生物的培养与应用”的第二个课题，学生已学习了有关培养基和无菌技术的基本知识，在掌握使用平板划线法和稀释涂布法、分离和纯化微生物的实验操作的基础上，研究培养基对微生物的选择作用，并测定其数量。其中既有关于特定菌株的选择策略等知识性内容，又有土壤溶液的稀释、菌落数量统计等操作性内容，难度较大、探究性较强，是培养学生设计实验、动手操作等科学探究能力，提高生物科学素养的好素材。

本课题教学实施中的关键在于两点：① 教师要处理好知识性内容与操作性内容的关系，要让学生理解特定菌株的选择策略，并学习有关的实验方法和操作程序;② 处理好课常与课后的关系。本课题的实验操作时间不长，但是操作前要制备培养基、对培养基和其他操作用具进行灭菌，操作后的培养时间和对微生物进行观察则需要较长时间，因此需要教师精心设计教学程序，统筹安排教学时间。

根据这一教材特点，本课题教学可分2个课时进行，2个课时之间应留有2 d左右的间隔，以便进行微生物的培养与观察。

2 教学目标

2.1 知识目标

简述稀释涂布平板法分离微生物和进行微生物计数的实验原理;说出选择性培养基和鉴别性培养基的用途;归纳分离纯化微生物的原理和方法。

2.2 能力目标

学会制备土壤样本稀释液，学会用稀释涂布法将菌样液接种到固体培养基平板;学会用稀释涂布平板法进行微生物数量测定的方法。

2.3 情感、态度与价值观目标

体验科学知识的形成过程，加深对科学本质的理解;体会在实验活动中合作学习的有效性，养成严谨的科学态度。

3 教学准备

3.1 土壤样品的采集以及土壤溶液的配制

为保证实验取得预期效果，应选择经常施用尿素的农田，铲去表土后采集3～8 cm深度范围内的土壤;回实验室后，去除土壤中的植物枯枝败叶及其他杂物，用托盘天平称取样品10 g，加入到盛有90 g无菌水的锥形瓶中，震荡10 min，即制得101土壤溶液;制备完成后可置于冰箱冷藏室内备用（1～2 d）。

3.2 配制培养基并进行高压蒸气灭菌

配制牛肉膏蛋白胨固体培养基（配方：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加热溶解后，加水定容至1 000 mL。如条件具备可用琼脂糖代替琼脂）， 分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。

配制尿素固体培养基（配方：葡萄糖10 g，尿素1 g，KH2PO4 1.4 g，Na2HPO4 2.1g，MgSO4・7H2O 0.2 g，琼脂15 g，加热溶解后定容至1 000 mL），分装到100 mL 带棉塞的锥形瓶中，每瓶各25 mL。

将上述分装好的两种培养基、装有4.5 mL 蒸馏水的带棉塞试管、装有99 mL 蒸馏水的250 mL锥形瓶、包装好的培养皿进行高压蒸气灭菌。

4 教学过程

4.1 导入新课

教师讲解：尿素是动物体内蛋白质代谢终产物，也是农业生产中常用的化肥，但农作物并不能直接吸收利用尿素，而有些土壤微生物能产生并分泌脲酶。通过分解土壤中的尿素为自身和植物生长提供氮元素，由此引出课题：在特定的土壤中可以分解尿素的微生物的数量是多少？如何从土壤中的众多微生物中分离出能分解尿素的微生物？

4.2 分析原理，学生尝试进行实验设计

教师介绍Taq细菌的发现和选择过程，引导学生认识到研究微生物的分离和培养，是研究微生物利用的基础，而要选择出符合需要的特定微生物，则要从微生物的生理和代谢特点出发，创造有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。在此基础上，教师引导学生提出实验的初步设想，以尿素为惟一氮源，配制培养基，阻止不能利用尿素的微生物的生长，从而筛选出分解尿素的微生物。学生以实验小组为单位进行实验设计。由于本实验的综合性强，难度大，学生在设计实验流程时可能存在不少困难。教师一方面要鼓励小组内部开展讨论，逐步修正设计;另一方面也要适时的参与到各组的讨论过程中，提出合理的建议。

4.3 总结设计结果，得出可行的实验流程

让各小组展示设计结果，组织全体学生讨论，教师给予评价，最终得出可行的实验流程（图1），并要求学生明确各步骤的具体目的。根据教师课前所进行的预实验，所取的土壤样品中分解尿素的微生物大约为1.5×108个/g。因此，可选择让学生进行104、105两种土壤稀释液的涂布接种。这样既可保证实验效果，又减少了器材、试剂的用量，节约教学时间，提高教学效率。同时，以牛肉膏蛋白胨固体培养基的培养作为实验对照，以便让学生充分理解和认识选择性培养基的设计策略和选择效果。

4.4 学生分组操作

为节约教学时间，教师可在课前将前期备好的牛肉膏蛋白胨固体培养基和尿素固体培养基，用电磁炉加热融化后，于课前置于80 ℃的水浴中进行保温，保持融化状态，以便学生及时取用。

倒平板：将融化的两种培养基分发给每个实验小组，指导其按规范倒平板，将两种融化的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中，每个100 mL锥形瓶中盛有的25 mL培养基，可倒两个平板，每个实验组可制得两种平板共四个。制作完成后，分别编号，置于实验台上等待其冷却凝固。

配制104、105土壤稀释液：将101土壤溶液和经灭菌的装有4.5 mL 蒸馏水的带棉塞试管、装有99 mL 蒸馏水的250 mL锥形瓶分发给各小组，教师指导学生制备104、105两种土壤稀释液。具体的方法可由教师直接给出，也可由各小组自行讨论制定方法，因学生对微量移液器的使用不熟悉，教师应给予指导。

接种菌液，分离尿素分解菌：教师指导学生用微量移液器，各取0.1 mL104、105土壤稀释液，分别加入到装有牛肉膏蛋白胨培养基和尿素固体培养基的培养皿中，使用涂布器，在酒精灯火焰附近打开培养皿，将加入的菌液均匀涂布于整个培养基，盖上培养皿后，倒置于37℃恒温培养箱中培养。

以上为第一课时。在第二课时教学实施前，教师可组织学生定期观察培养情况。

观察对比培养结果并计算：2 d后观察比较牛肉膏蛋白胨培养基和尿素固体培养基中菌落的形态并计数。可以明显地发现，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态多样，数目较多，而且随稀释倍数的增加，菌落的数目减少。而尿素培养基上的菌落形态比较单一，数目也明显少于对应稀释倍数的牛肉膏蛋白胨培养基上菌落。学生根据计数结果，计算出土壤中分解尿素的微生物的数量。例如学生计数在105稀释倍数的培养基上出现的菌落为60个，则每克土壤中尿素分解菌数量为60×5×105×10=3×108个/g。

4.5 小组讨论，促进学生对微生物选择性培养的理解

学生完成分组操作后，教师可设计问题，引导学生巩固有关微生物培养的原理和方法，加深其对微生物选择性培养的理解。具体问题及设计意图如下：

（1） 牛肉膏蛋白胨培养基中，提供碳源和氮源的物质分别是什么？

（2） 尿素固体培养基中，提供碳源和氮源的物质分别是什么？

（3） 你所在的实验小组的培养结果如何？按生长菌落的多少，将4只培养皿排序，从多到少的顺序是什么？为何会出现菌落数量的差异？

（4） 你所在的实验小组，实现了对土壤中分解尿素的微生物的选择性培养吗？为什么？

以上问题串从复习上一课题介绍的微生物培养过程中的碳源、氮源入手，让学生体会不同微生物在生长过程中利用的碳源和氮源是不同的，从而引导其深刻理解微生物的选择性培养的思路，进一步掌握特定微生物的选择和分离的方法。

4.6 设计“意外”，引导课题延伸

教师展示学生的实验结果，从中选择符合实验预期的尿素固体培养基，打开培养皿，使用手持式喷壶，向培养基表面喷入事先配好的质量分数为0.1%的酚红试剂，静置片刻，让学生观察现象。

教师讲解并提问：酚红试剂是一种酸碱指导剂，其变色范围是pH6.8（黄）～8.4（红），观察到的培养基上的颜色有何变化？这说明了什么问题？

学生通过观察可知，在培养基上出现了两种不同类型的菌落，一种菌落周围出现了红色圈，另一种则呈现黄色。这说明这些微生物的种类是不同的，菌落周围变红的说明微生物培养过程中产生了碱性物质，而菌落周围变黄则说明产生了酸性物质。

教师给出如下资料，指导学生阅读：

资料：微生物将含氮有机物分解产生氨的过程被称为氨化作用。能进行氨化作用的细菌统称氨化细菌。有些氨化细菌能分泌脲酶，可将尿素分解生成氨，为微生物提供氮源，如脲芽孢八叠球菌。

硝化细菌可利用氨氧化过程中释放的能量，将无机物转化成有机物而营自养生活，其中能将氨氧化成亚硝酸盐的称为氨氧化细菌，如亚硝化单胞菌;能将亚硝酸盐氧化为硝酸的是亚硝酸氧化细菌，如硝化杆菌等。

教师要求学生根据以上资料，进一步判断培养基上出现的两类菌群，分别是资料所给出的哪一类细菌。

在此基础上，教师提出问题：本实验中使用的尿素固体培养基中的惟一氮源是尿素，其目的在于选择土壤中的分解尿素的微生物，那么为何在培养基中出现了以氨为氮源的氨化细菌？如果想进一步选择分解尿素的微生物应该怎么做？

笔者设计这一问题串的目的在于帮助学生理解选择性培养基和鉴定性培养基的用途。借此问题，教师引导学生认识到，尿素分解菌可将尿素分解为氨，这时培养基中的氮源的种类就发生了变化，由原来的尿素是惟一氮源变成了除尿素外还存在其他的氮源。因此，可在这样的培养基上生长的细菌，有些是可以分解尿素的，有些则是以氨为氮源的杂菌。而要想选择出其中分解尿素的微生物，可在配制尿素固体培养基时加入酚红起到鉴别作用，然后用灭菌后的接种环，挑取菌落周围出现红色区域的微生物进行接种培养。

4.7 总结归纳

在总结归纳阶段，教师可设计一系列问题，引导学生回顾微生物分离纯化的方法和实验设计的思路，具体问题如下：

（1） 分离纯化微生物的方法有哪些？（平板划线法、稀释涂布法、选择培养基分离、鉴别性培养基鉴别后挑取接种）

（2） 本实验中，为何要设计使用牛肉膏蛋白胨培养基培养土壤微生物的步骤？（设置对照，通过比较实验组和对照组培养基上菌落的数量和形态，证明尿素固体培养基的选择效果）

（3） 要想提高土壤中尿素分解微生物计数的准确性，应该怎么做？（设置重复，取均值，减少实验误差）

（4） 请归纳微生物计数的方法。（稀释涂布法、血球计数板、比浊法等）

以上教学过程充分挖掘了该课题的教学价值，使课程标准中“微生物的分离与培养、微生物计数、选择性培养基的选择作用”等具体要求得到有效落实，同时，该教学过程较好地处理了知识性内容与操作性内容及课堂与课后的关系，可起到节约时间，提高教学效率的效果。

参考文献：

微生物培养的方法第3篇

关键词：植物；微生物；培养技术

一、植物内生微生物研究特点

近些年来，关于植物内微生物的研究发展迅速，主要着重医药指向、农业指向、环境指向等四个方面的研究。从整体趋势来看，我国植物内微生物研究的特点为：资源探索多，分离培养多，活性监测和生物功能研究多，基础性前期工作多；方法研究少，涉及林木少，与宿主的关联少，实际应用少。在研究程度上初步研究多，深入研究少。以抗菌、抗肿瘤等药物开发为目的的资源探索性研究最多，而宏观生态学中的天然林木及草原野草中的内生微生物研究较少。生态研究方面的侧重点也不同。对于微生物的群落结构、生态分布、培养条件优化等研究较少。

二、植物内生微生物研究现状

我国在医药指向的研究，涉农的植物内生微生物的研究，环境指向的研究，挥发性物质生产、食品指向的研究，生物安全评价、微生物资源的研究，重要粮食作物内生微生物的研究、有害植物内生微生物的研究等方面遍地开花。值得特别关注的，如王剑文、谭仁祥等提出的利用内生菌寡糖诱导黄花蒿发根合成青蒿素的研究，指明了植物内生微生物利用的一个新方向，提醒我们对内生菌和宿主的相互作用的关注。我国对于转Bt基因棉花茎秆内以及转Bt基因的水稻植株各部位的内源微生物的变化，从植物体内的微生物生态环境变化的角度为基因作物的风险评估提供新的思路。

三、存在问题及解决方法

1.存在问题

在微生物培养过程中，诸如深海、高压、低pH值、缺氧等极端环境在现有的条件下无法再现，人工培养环境忽视了天然状态下生物种群间的关系，如共代谢、互养共栖、拮抗、寄生等，在常规培养过程中，无法提供完全相似的环境，忽视了群体效应，原有的生态关系、信息交流被破坏。当分别转接到培养基中时，因缺乏潜在的外源活性物质，有些微生物不能存活。微生物在自然环境中通常需要生命活动所需的活性物质。此外，一些植物、动物病原菌对寄主活性物质的依赖在常规培养条件下难以实现。

2.解决方法

针对不同的环境需求提出不同的改善措施。如，海洋中低营养的状态，Button等提出并采用了稀释培养法，使得培养的可能性大大提高。该种方法也被应用于淡水湖泊的微生物生态学研究中。由扩散盒培养技术和细胞微囊包埋技术组成的模拟自然环境的培养技术从细胞层面还原最原生态。根据微生物的特性，有选择性地在传统培养的基础上添加必需的养分，使原本无法培养的变成可培养的成分并且在放线菌领域也产生了新方法：将装有灭菌琼脂的塑料容器分别用有半透性的薄膜密封，由此将丝状真菌排除在装置外。将装置放置在土壤中，室温黑暗条件下培养2～3周后，将中间琼脂层取出，经镜检观察即可得到放线菌菌落。相比较于传统方法，用这种方法得到的放线菌类数量更多、种群更多样化。

参考文献：

[1]徐 瑞，南志标，周雁飞，等.披碱草内生真菌共生体中麦角生物碱的组织分布与季节动态[J].草业学报，2012，21（3）：84-92.

[2]许 乐，阮小蕾，李冬丽，等.对枯萎病不同抗性的香蕉品种的内生细菌多样性及群落结构[J].微生物学通报，2012，39（9）.

[3]王剑文，郑丽屏，谭仁祥.促进黄花蒿发根青蒿素合成的内生真菌诱导子的制备[J].生物工程学报，2006，22（5）.

[4]姜 楠，汪小福，徐俊锋，等.转Bt基因对水稻内生原核微生物定殖数量效应分析[J].浙江农业学报，2012，24（5）.

[5]彭伶俐，王 琴，辛明秀.自然界中不可培养微生物的研究进展[J].微生物学杂志，2011，31（2）.

微生物培养的方法第4篇

关键词：微生物检验；质量控制措施；浅谈

目前在实际进行微生物检验的过程中，最为常见的一种检验方式就是通过培养基，对于微生物进行相应的培养，等到微生物能够大量的繁殖后进行相应的检验。为了保证到微生物检验过程中的相关效果，对于培养基的质量实施相应的控制就显得尤为重要。但在实际的使用微生物检验培养基的过程中，往往无法严格按照相关要求进行，因此对于微生物检验培养基质量控制措施进行讨论，就显得尤为重要。

1 对于微生物培养基在进行质量控制的措施

目前在实际的对于微生物培养基在实施质量控制的过程中，主要是需要在进行购置的过程中，可以对于进行检验的各种药品、试剂以及相关的培养基均需要严格的按照相关的质量标准来进行，同时对于生产厂家而言，也需要提供培养基的编号、批号以及名称等，同时对于培养基在使用过程中的储存相关资料、PH值以及产品的有效期限等信息，也需要进行准确的标注[1]。我们可以尽量的选择一些大厂生产的培养基进行使用。这主要是由于微生物培养基大厂生产的培养基能够较好的保证到在实际的使用过程中，能够严格的按照相关质量标准来进行检验，因此能够较好的保证到对于微生物实施检验过程中的准确程度。同时在进行验收的过程中，需要足以到应该由专人来进行检验以及验收，通过这种方法，可以对于在实际的进行微生物培养基的使用过程中的相关质量标准可以在一种较高的水平之上，并对于培养基的质量进行检测完成后，若能够符合相关的检测要求，就能够进行使用。

2 对于培养基的储存质量控制措施

对于不同种类的培养基，实际上在进行质量控制过程中所需使用的方法，实际上是不同的。对于一些粉末状的培养基，在实际的进行储存的过程中，需要注意避免出现阳关直射的情况。若培养基没有进行开封，可以保存最长2年的时间，若已经开封，则使用时间为6个月。若在此过程中没有将培养基进行使用完[2]，需要放弃培养基采购全新的培养基。同时为了定期的对于培养基进行常规的检验，若在此过程中，检查的是没有开封的培养基，可以对于培养基的生产日期或是开封日期等进行观察，若在此过程中，出现培养基的颜色异常或是出现了诸如结块等情况，需要放弃培养基。

3 对于培养基实施制备过程中的质量控制措施

在对于培养基实施制备的过程中，制备培养基使用的水应该使用蒸馏水或是和蒸馏水相同质量的水，以保证对于培养基进行制备的过程中不会出现污染等情况，同时也需要避免出现使用离子交换器水的情况。在对于培养基进行称量的过程中，也需要注意到在实际的实施称量的过程中，需要通过使用专用的工具进行称量，同时在此过程中，也需要保证到避免出现污染的情况。由于干粉状态的培养基在实际的使用过程中，极易出现受潮的情况，因此如果条件能够允许，尽量在干燥的房间中对于培养基进行称取[3]。同时在进行配制的过程中，可以按照生产厂家提供的配制内容方面进行相应得到配制，以保证能够正常的对于培养基进行制备。在制备完成后若需要使用复水的工作，尤其要避免出现使用金属锅具进行复水，通过这种形式可以较好的避免出现离子混入培养基中的情况，导致对于微生物的生长不利。同时在此过程中，对于容器的选择方面，大小需要在复水后的培养基实际体积的至少2倍，通过这种形式能够较好的避免在进行培养的过程中[4]，出现了培养基的溢出的情况，而在对于培养基在实施培养加热的过程中，一定要注意到不断的进行搅拌，通过搅拌的方法，能够较好的避免出现培养基的溢出或是烧焦的情况。由于烧焦的培养基会产生有毒物质，对于微生物的培养而言，会出现抑制的效果，因此若是在此过程中已经出现了培养基的烧焦情况，需要重新的制备培养基，以保证正常的对于培养基进行制备并能够对于微生物的培养较好的进行[5]。在对于培养基实施测定以及灭菌的过程中，我们一般可以选择在121℃的环境之下实施灭菌，同时灭菌的时间一般在15min左右，通过这种方式，能够保证到微生物的生长繁殖的消耗养分能够进行消除，同时对于培养基的酸碱度能够得到相应的保证。在对于PH值实施测定的过程中，常见的测定方法主要是氢氧化钠的测定方法，但需要避免在此过程中出现渗透压的改变现象。对于已经进行配置完成后的培养基，我们需要进行较好的保存，在此过程中，应该迅速的对于培养基进行冷却的处理，冷却的温度为微生物进行培养过程中的所需温度，在此过程中可以对于培养基实施密封的保存，以保证其使用效果。

参考文献：

[1]刘春梅，蔡芷荷，吴清平，等.食品卫生微生物检验中培养基的质量控制[J].中国卫生检验杂志，2007，17（4）：700-701.

[2]周桂桃.微生物检验中培养基的质量控制对策分析[J].按摩与康复医学（下旬刊），2012，3（11）：26-27.

[3]贾月波.论食品微生物检验中培养基的质量控制措施[J].中国保健营养（中旬刊），2013，（4）：18-19.

微生物培养的方法第5篇

一、微生物不可培养的原因

对微生物进行常规培养时,由于生活条件的改变,有些微生物不能适应而死亡,另一些则通过产生孢子进入休眠状态或改变细胞形态、进入维持一定代谢活性但不生长繁殖的“活的非可培养状态”,结果均表现为微生物的“不可培养性”。

实际上,微生物的不可培养性是由于对微生物生长条件及其规律性的认识严重不足,而采取了偏离微生物生长实际情况的培养条件所造成的,这些偏离具体可以包括以下几个方面:

(一)实验室中无法完全模拟自然界的环境条件

由于目前监测技术和手段的限制,人们对微生物生存环境和自然条件的了解尚不充分。因此,人们没有或无法完全模拟微生物的自然生存条件,而通常将培养条件进行简化:将微生物置于恒温、恒湿、黑暗等环境中;将微生物限制在“板结”的琼脂或不扰动的液体介质中;简化微生物的营养组成没有提供微生物生长繁殖所必需的某些化学物质等等。所以在自然界中可以生长繁殖的微生物,在“纯培养”中生长条件得不到满足,从而导致了微生物的不可培养性。

(二)生长缓慢的微生物被忽视

环境中很多微生物都聚集生长,当将这些微生物接种至培养基时,适合生长的微生物由于生长快而占据优势地位,它们对营养成分的大量摄取使生长缓慢的微生物得不到充足营养而生长受到抑制。

(三)采用高浓度的营养基质

最初对微生物的培养是在富含营养的培养基中进行的,但是由于自然界中微生物数量庞大,其可利用的营养物质极度匮乏,多数处于“岔营养”状态。常规纯培养对这种认识不允分,通常将寡营养微生物迅速置于富营养状态,微生物初期的快速生长会产生大量的、微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化物和羟基自由基等“毒性氧物质”,该类物质快速、过量的积累会破坏细胞内膜结构,导致细胞死亡,从而表现出微生物的不可培养性。

(四)环境微生物之间的相互关系被忽略

微生物相互关系繁多复杂,包括:(1)种间的偏利共生关系和互惠共生关系,两者的共性是至少一个群体提供另一些群体所需的生长因子而使微生物群体获利;(2)群体感应,这种关系被认为是通过细菌间的信息交流来调控细菌的群体行为:细胞通过感应一种胞外低分子量的信号分子来判断菌群密度和周围环境的变化,从而调节相应的细菌表达以调节细菌的群体行为。以上这两种关系都是微生物生长所必需的。由于人们目前对环境中微生物之间多数复杂的相互关系所知甚少,采用的培养技术没有将这种关系考虑在内。纯培养技术将待培养的微生物与其它微生物群体、以及生存环境人为地分离开,种间的共生关系和信息交流被阻断,微生物缺乏必需的生长因子和信号分了而死亡,表现出微生物的不可培养性。

(五)对微生物生长状况进行判断的常规标准存在的缺陷,也导致某些微生物生长不被发觉,表现为“不可培养”

微生物培养的方法第6篇

一、从微生物学教学目的来分析课程改革的必要性

职业学校药学类专业学习微生物这门课程，总体有这样几个目标：1.药品生产各环节的消毒灭菌处理工作。2.GMP车间在环境和工作人员方面对微生物的要求。3.环境中微生物的检查工作。4.一般微生物的培养，接种技术。5.显微镜观察微生物，微生物的染色技术。6.一般微生物的鉴别方法。7.对于生物制药专业来说，为下一步学习发酵技术等专业课打下基础；对药物分析专业学生来说，为下一步学习药品生物检定技术打下基础。

总结这些生产中的实际要求，我们得出结论：微生物学的教学应该以实际操作技术为主要与重点内容。因此笔者对微生物学进行分析总结，将上课地点搬进了实验室，将实验归纳总结为一个个的项目，把理论知识也附着在实验项目之中。

二、将各个实验进行统筹安排的必要性

在实验的时间先后上，如果没有统筹的安排，将会有很大的材料浪费和人力的浪费。因此，我们将所有的实验进行统筹规划，将前一个实验制备的产品用于下一个实验，这样既有连贯性，同时还有很大的节省。

三、课程改革内容

将整个教材分为以下几个试验模块：1.培养基的制备与灭菌；2.微生物的接种与培养；3.微生物菌苔菌落的观察；4.微生物的染色技术与显微镜的使用方法；5.细菌大小与数目的测定；6.微生物在自然界的分布；7.体外抑菌试验；8.抗生素的效价测定。

四、具体模块分析

(一)培养基的制备与灭菌。本模块任务：1.配置培养基（通过实验操作掌握固体、液体、半固体培养基配置方法，同时掌握微生物生长必需的条件），2.将培养基进行包扎灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方法，干热灭菌法原理及操作方法，同时掌握彻底灭菌（包括芽孢）的方法及意义）。通过这个模块的学习，学生不仅掌握了基本的配制、分装、包扎、灭菌技术，还为下面的所有实验准备了试管装的斜面培养基和三角瓶装固体，液体培养基。

（二）微生物的接种与培养。本模块任务：1.试管的斜面接种，2.培养皿的分离划线培养，3.三角瓶的液体接种培养。通过这个模块的学习操作，学生能够掌握的操作技术：使用酒精灯的无菌操作技术，固体、液体培养基的接种技术，如何分离得到纯种细菌的技术；学习到的理论知识：菌落及菌苔的含义，微生物的培养方法；同时为下一步的实验准备了大量的微生物培养物。

（三）微生物菌苔菌落的观察。本模块任务：观察各类微生物的菌落菌苔特点。本实验直接取上次实验培养的微生物培养物进行观察，从而概括得出细菌、放线菌、真菌三大类微生物菌落各自的特点作为鉴别的依据。

（四）微生物的染色技术及显微镜的使用方法。本模块任务：1.将微生物进行单染色、革兰氏染色，2.光学显微镜观察微生物形态。为了进行这两项操作，学生会主动学习染色原理，显微镜操作原理，油镜使用原理，然后进行实际操作。本模块使用模块二的培养物来进行染色观察。

（五）细菌大小与数目的测定。本模块任务：使用血细胞计数板和测微尺进行微生物数目和大小的测定。

（六）微生物在自然界的分布。本模块任务：检测微生物在土壤、水、空气、人体表面的分布情况。本实验使用模块――配制的固体培养基倒平板进行检测。

（七）体外抑菌实验。本模块任务：使用琼脂扩散法进行检测几种化学消毒剂的抑菌实验。本实验使用模块――实验中配制的培养基。

（八）抗生素的效价测定：本模块的任务：使用二剂量法测定一种抗生素的效价。本实验使用模块――实验中配制的培养基。

五、考试考核方法

根据教学过程的模块化改革，考试考核方式也随之进行改革，由原来传统的一张理论试卷定分数的方式，改为以实验为主要考核方式。将模块的结果进行考评打分，在最终成绩中占重要比例，然后学习结束时的考核分两部分，一是实验室内现场操作考核：从八个教学模块中选取一些重要的操作技术，比如染色技术、灭菌锅的使用技术、培养基配制方法等等，学生抽题，抽到后现场进行操作考核；二是抽取两个理论题进行回答。实践证明，这种考核方式更与实践相接近，更具有实际意义。

六、总结

实践证明，以项目实验为主体，理论辅助在其中，学生能够很好地掌握实践技术操作，能够较好地适应职业教育的要求，而且能够将单个独立的项目实验联系起来，不仅教学效果好，还节约了很多实验材料。

参考文献：

微生物培养的方法第7篇

关键词：微生物；发酵工艺；工艺优化；培养基；培养条件 文献标识码：A

中图分类号：TQ920 文章编号：1009-2374（2017）01-0031-02 DOI：10.13535/ki.11-4406/n.2017.01.015

根据已有的相关参考文献可知，微生物发酵影响的因素包括发酵培养基中的碳源、氮源，无机盐，pH值以及温度等，本文对这些影响因素展开了详细的研究。微生物发酵工艺的优化可以有效地提升发酵生产效率，进而使得发酵生产成本有效降低。针对于此本文探讨了正交试验设计法、响应面设计法以及Plackett-Burman设计法等微生物发酵工艺的优化方法。

1 培养基对发酵的影响

微生物发酵的培养基在微生物生长或者代谢时提供所需的营养物质和能量，对发酵产物的生物合成效率以及保障产品的质量可谓是意义重大。在微生物发酵中由于菌种和发酵条件的差异以及发酵阶段的不同，所需的培养基成分也有所差异。在通常情况下，碳源、氮源、o机盐以及生长因子是微生物生长的四大营养要素。

1.1 发酵培养基碳源和氮源的选择

碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞以及形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂等，比如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及豆油等。氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的重要来源，与此同时，氮源也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源以及有机氮源，比如氨盐、硝酸盐、蛋白胨以及豆粉等。需要保持培养基配方中碳/氮源比例均衡，从而保证满足菌体的正常生长，同时提高产物的合成速率。

1.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响

无机盐对代谢产物的生成及微生物的正常生长都具有相当重要的影响。在微生物的生长代谢过程中，磷参与了微生物细胞中核酸等辅酶的构成，是微生物能量代谢、生长的重要因素之一。在苏云金芽抱杆菌的发酵产物苏云金素的分子结构中包含磷酸根，所以在其发酵培养基中添加更多磷酸盐，更有利于产物苏云金素的合成。钙离子在微生物发酵过程中的主要作用是调节细胞的生理状态，比如说维持细胞的胶体状态、降低细胞膜的通透性等。与此同时，在大多数发酵培养基里面，添加适量的CaC03，能够对发酵液含菌量的变化起到相当明显的影响，其主要原因是CaC03的添加对发酵液的pH值具有非常良好的缓冲作用，从而大大改善了菌体的生长环境。镁元素是许多酶的催化剂。锰、锌、铁、钼以及钴等元素是微生物所需要的微量元素。已有大量的相关研究表明，锰离子是枯草芽抱杆菌生长必不可少的元素，有很多相关方面的学者及研究人员通过研究指出，将适量的MnCl2添加到发酵培养基里面，能够使枯草芽抱杆菌发酵产物抑菌物质活性得以有效地提升。

2 培养条件对发酵的影响

2.1 种子质量对发酵的影响

微生物发酵中接入的种子质量对菌的生长以及产物的合成具有非常大的影响。种子的质量取决于以下两个方面，其分别为接种量以及接种的种龄。在发酵培养基中接入合适的接种量以及种龄适宜的优质种子液，能够使目标微生物更加迅速地进入到对数生长期，从而使发酵周期大大地减短，进而促使产物质量得以有效提升。如果种龄过长则会直接导致菌体过早的发生衰退，菌体的生产能力也随之而有一定程度的下降；如果种龄过短，则会直接导致菌体生长缓慢，产物合成时间大大推迟。若接种量过小，那么便会使得菌体细胞的生长量变小，从而使得对数生长期的时间、发酵时间有所延长，进而对一些酶及产物的生成造成极为不利的影响；如果接种量过大，那么便会直接加快微生物培养基的消耗速度，促使菌体生长过快，进而使得菌体提前进入到稳定期与衰亡期，对产物的合成造成极大的负面影响。

2.2 温度对发酵的影响

温度是保证酶活性的重要条件之一。过高的温度环境会对微生物细胞内的酶活性造成一定程度的破坏，严重地抑制微生物的正常生长，并且微生物细胞内的蛋白质在过高的温度环境下极易发生凝固或者变性，最终造成细胞死亡；而过低的温度环境也会对微生物的生长造成较大程度的抑制作用，故在发酵过程中必须保证最为适宜的温度环境。不同微生物菌种的生长温度不同，而生长与产物合成阶段的最适温度也有差异。在发酵温度的设计过程中要综合考虑其他的发酵条件及因素，比如培养基成分、能源消耗、发酵周期和产率水平等，必要时还可以考虑变温培养。

2.3 pH值对发酵的影响

最适pH值在很大程度上会直接影响到不同种类微生物生长以及产物的合成。pH值对微生物的影响主要是影响各种酶的生命活力，进而使得微生物的新陈代谢与生长繁殖发生较大的改变；除此之外，pH值对营养物质的利用以及细胞结构也有相当重要的影响。pH值会显著地影响培养基中的营养物以及中间代谢产物的解离，进而使微生物对这些物质的利用与吸收发生一定的改变。常亚飞等人在探究苏云金芽抱杆菌的过程中发现其芽抱萌发率在pH值7.0时最高，其芽抱萌发率在pH值过大或者过小时仅为40%，除此之外，若培养基pH值过高或者过低，还会直接影响到毒素产量，甚至有可能导致完全不产生伴胞晶体毒素。

2.4 溶氧对发酵的影响

溶氧是好氧微生物生长所必须的关键因素之一，只有提供足够量的氧才能维持菌的正常生长、代谢。溶氧对次生代谢产物的合成途径影响显著，而且还会对代谢的合成速度造成一定程度的影响。如果氧不足，那么便会造成微生物对营养物质的有氧氧化过程不能彻底地进行，从而影响发酵液pH值，产生有毒物质，与此同时，还会影响产物合成所需的前体物质的积累，进而影响菌体的生长以及产物的生成。在微生物发酵的过程中，通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。摇瓶发酵可以采取降低装液量、增加转速来有效地增加溶氧量。叶云峰等人通过实验研究发现，装液量对枯草芽抱杆菌B47产抗菌物质的影响是最为显著的，菌体生成产物的能力随装液量的减少而大大增多，这充分地说明溶氧对产物合成具有正面的影响。

3 微生物发酵工艺优化的方法

通常情况下，微生物发酵工艺优化可以从培养基成分比例及培养条件两个方面进行优化。最近几年以来，随着统计学在微生物发酵领域的有效应用，优化方法从单因子设计法逐步发展成为正交试验设计、均匀设计等方法，更加系统高效。愈来愈多的研究人员通过统计软件对试验结果进行数学模拟与优化，利用Plackett-Burman试验设计方案来对优化因子进行科学的筛选，再在中心组合实验设计基础上采用响应面分析法以达到优化的目的。本文对目前集中比较常用的优化方法进行了比较详细的探讨。

3.1 正交试验设计法

正交试验设计法是利用正交表来分析多因素问题，通过多因素多水平实验得出相应的结果，然后再通过直接对比与直观分析来找出最佳的因素水平组合，通过这种方法可以对影响微生物发酵的主要因素进行确定。正交试验设计法具有方法简单、效率高以及工作量小等S多显著的优点，所以在对微生物发酵工艺进行优化的过程中，正交试验设计法是应用得最为普遍的方法。

3.2 Plackett-Burman设计法

Plackett-Burman法主要针对因子数较多且未确定众因子相对于响应变量的显著影响，采用的试验设计方法。能够及时有效地筛选出对试验结果具有显著影响的关键因素。在通常情况下，使用Plackett-Burman设计法开展的N次试验最多能够研究（N-1）个因素，对每个因素取两个水平，通常是设低水平为原始培养条件，高水平为低水平的1.25倍，通过对各个因素两水平的差异与整体的差异进行对比分析来对因素显著性进行确定。需要加以注意的是，如果因素水平选取得不合适有可能导致Plackett-Burman试验结果无效，从而需要重新选取因素来进行再一次的试验；如果Plackett-Burman试验的模型有效，那么则可以确定对试验具有显著影响的因素，然后下一步可以通过开展响应面设计等方法来筛选出最优的条件。袁辉林等利用Plackett-Burman设计方法获得了预期结果。

3.3 响应面设计法

响应面设计法主要结合统计分析、数学建模等方法经过试验设计来对相关数据进行分析，并利用多元二次回归方程来拟合函数关系，进而实现优化工艺参数的目的。响应面设计法对变量因素比较多的微生物发酵的参数优化效果是相当良好的，在Plackett-Burman试验结果的基础上，可以准确地确定出最优培养基配方、发酵因素等，从而有效地提高微生物发酵的产量。响应面设计法的适用范围是非常广泛的，其在生物学、制药、医学等方面已经获得了非常成熟的应用，且取得了良好的应用效果。

4 结语

随着科技的不断进步以及生物技术水平的持续提升，微生物发酵技术已经得到了非常广泛的发展，除了在农业与工业方面获得了广泛的应用外，其在医药领域的应用更加值得期待。利用微生物发酵技术可以有效地解决许多正常生产不能够解决的难题。合理运用微生物发酵技术，并对发酵工艺进行持续地优化与改进，可以有效地提升生产效率，推动发酵工程技术不断前进与健康发展，从而扩大微生物发酵在各领域的应用价值。

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微生物培养的方法第8篇

意义

无土栽培是指不用天然土壤，而使用营养液或固体基质加营养液的栽培方法。固体基质或营养液代替天然土壤向作物提供良好的水、肥、气、热等根际环境条件，使作物完成从苗期开始的整个生命周期。无土栽培是实现蔬菜由传统大田生产向工厂化、规模化、集约化转化的新型栽培方式。

无土栽培的植物主要依靠营养液提供生长发育所必需的营养元素。目前营养液的使用存在以下问题：①营养液容易缺氧。无土栽培尤其是水培，因营养液层较深、根系活动范围小，容易造成氧气供应不足。作物根系缺氧时，其生长缓慢，水分及养分吸收减弱，从而影响地上部分生长，导致产量下降。②营养液的循环使用容易接触病原菌。植物根系一旦染病，传播会非常迅速，短时间内就能使整个栽培系统全部染病，造成重大的经济损失。因此，开发一种经济高效的循环营养液增氧和消毒方法成为亟待解决的重要课题。

营养液增氧和消毒的方法

增氧技g

在植物根系生长发育过程中，呼吸过程要消耗氧气，为使其能正常生长就需要有足够的氧气供应。无土栽培植物根系生长环境可以是在类似土壤的生长基质中，也可以是在与土壤环境截然不同的营养液中。因此，在无土栽培中根系氧气的供给是否充分及时，往往会成为制约作物生长的重要因素。

营养液中氧气溶解量可以用溶解氧浓度（DO）表示。溶解氧浓度是指在一定温度、一定大气压力条件下，单位体积营养液中溶解的氧气的数量，以毫克/升（mg/L）表示。营养液中溶解氧的多少与液温、大气压有关，温度越高大气压力越小，营养液的溶解氧含量越低；反之，温度越低大气压力越大，其溶解氧的含量越高。这是导致夏季高温季节水培植物根系容易缺氧的一个原因。

在植物生长过程中，营养液中溶解氧还与植物根系和微生物的呼吸有关，同一植物在白天和夜间对营养液中的溶解氧的消耗量也不尽相同。晴天时，温度越高，日照强度越大，植物对营养液中溶解氧的消耗越多；在阴天，温度低或日照强度小时，植物对营养液中溶解氧的消耗较少。植物根系的耗氧量与根系数量、呼吸数量、呼吸强度成正比，因此耗氧量取决于植物种类、生育时期、种植密度。生长过程耗氧量大、处于生长旺盛期以及每株植物平均占有营养液液量少的植物，则营养液中的溶解氧的消耗速率较大；反之，溶解氧的消耗速率较小。一般甜瓜、辣椒、黄瓜、番茄、茄子等瓜菜或茄果类作物的耗氧量较大，而蕹菜、生菜、菜心、白菜等叶菜类作物的耗氧量较小。另外，营养液内的还原性物质被氧化时也要消耗一些溶解氧。

一般营养液中的溶解氧含量维持在4～5 mg/L

以上，能满足大多数植物的正常生长。但是无土栽培别是水培营养液中的溶解氧很快会被消耗掉，因此必须采取一些方法来补充植物根系对溶解氧的需求。营养液溶解氧的补充，实质上是通过破坏营养液液相与空气气相之间的界面而让空气进入营养液的过程。在一定的温度和压力条件下，液-气界面被破坏得越剧烈，进入营养液的空气数量就越多，溶于营养液的氧气也越多。补充营养液溶解氧的途径主要来源于空气向营养液的自然扩散和通过人工的方法来增氧。自然扩散进入营养液的溶解氧的速度慢，数量少，远达不到作物生长的要求。人工增氧的方法包括营养液循环流动、落差法、喷雾、增氧器、间歇供氧、滴灌、压缩空气、反应氧、动态液位法等，其原理和特点见表1。

营养液循环流动、落差法、喷雾法和增氧器等都是通过增加营养液与空气的接触而提高营养液中的溶氧值，陈艳丽[2]在研究水培生菜有机态氮的营养效应及营养液溶氧管理技术时发现，水泵增氧达到溶氧浓度的饱和点后不再增加，这也可能是几种方法的共性。滴灌法、潮汐法均通过间歇供氧的方法，将根系暴露于空气中直接吸收氧气。甘小虎等[3]研究辣椒潮汐式灌溉育苗技术时指出，育苗过程中基质始终疏松透气不易板结，具有降低能耗、减少用工、节约用水等优点。动态液位法同时采用了增加营养液与空气的接触以及暴露根系于空气中的方法来增加根系对氧气的吸收效率。宋卫堂等[1]对动态液位法的研究表明，提高根系对氧气的吸收效率可以提高番茄的相对生长率、增强根系的活力、促进根系的生长发育。不同的增氧方式应用于不同的无土栽培方式，往往是几种增氧方式协调增氧。夏季高温时营养液增氧困难是制约增氧效果的一个关键问题。

消毒技术

营养液灭菌消毒的方法比较多，包括化学药剂消毒、高温消毒、紫外线消毒、臭氧消毒、慢砂过滤消毒等[4-11]。宋卫堂等[10]对营养液加热消毒机的研究表明，75℃、90 s的杀菌组合对（3.9×105～8.3×105）cfu/mL番茄萎蔫病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、番茄细菌性青枯病病原菌达到100%的杀菌效果。刘楠等[11]研究循环消毒装置时指出，在0.57 mg/L臭氧浓度下，对空心菜的生长有一定的促进作用，可以增加空心菜产量，而对于臭氧在营养液消毒及水培空心菜的影响等需进一步的试验研究。刘伟等[7]研究慢砂过滤装置时指出，慢砂过滤对病毒、线虫及部分细菌的消除率达到90%～99%，不会杀死营养液中所有的微生物，可以利用有益微生物抑制病原微生物，因此慢砂过滤用于营养液消毒还需要进一步研究与完善。宋卫堂等[9]对紫外线-臭氧组合式营养液消毒机进行了研究，UV、O3、UV+O3 3种方法的消毒效果分别达到70.6%、15.9%和89.9%。紫外线-臭氧组合式消毒比单一灭菌方法效果更好，显现出了协同效应，可以较大幅度地提高消毒效率。各消毒原理和作用见表2。

营养液微纳米气泡

增氧消毒技术

针对现有无土栽培营养液增氧效率低，各种消毒方法单一使用，存在环境污染大、运行成本高以及效果差、效率低等问题，一种新型高效的无土栽培营养液的增氧、消毒技术――“营养液微纳米气泡增氧消毒系统”经研发并逐步推广。

营养液微纳米气泡增氧消毒系统采用国际先进的微纳米气泡发生技术，并结合臭氧杀菌技术、紫外线消毒技术等，解决营养液供氧不足以及因病原微生物侵害而造成的无土栽培作物生长受抑制、产量下降等问题，避免由此造成的经济损失，在设施农业领域具有很好的实用性。

微纳米气泡发生技术是利用微纳米气泡快速发生装置将气体快速高效溶入水中产生微纳米气泡。微纳米气泡的显著特点是其在水中上升缓慢，停留时间长，并产生自我压缩，在水中具有很高的溶解度，并且微纳米气泡具有促进植物生长的生理活性，因此微纳米气泡技术被认为非常适合应用于水培栽培系统[12]。此外，利用微纳米气泡发生技术将气体溶入水中，与其他曝气方式相比，受温度影响较小，在夏季高温季节使用具有显著优势。

营养液微纳米气泡增氧消毒系统的技术原理：利用微纳米气泡发生技术将氧气溶入营养液中形成微纳米气泡富氧水对营养液进行增氧；利用微纳米气泡发生技术将臭氧溶入营养液中形成微纳米气泡臭氧水，并经过紫外线消毒器对营养液发挥协同消毒作用[13]。

营养液微{米气泡增氧消毒系统的创新点：①利用微纳米气泡发生技术使氧气、臭氧在水中高效溶解，生成的微纳米气泡具有缓释效果，可延长氧气、臭氧在水中的存留时间，提高利用率；②臭氧、紫外线协同作用灭菌，臭氧与有机物分子反应需要活化能，紫外线的照射提高了有机物分子能量，使活化分子比例增多，从而使有机物更容易在臭氧的氧化下分解。另外，水中溶解的臭氧在紫外线照射下能够生成反应活性更高的羟基自由基（OH-），进而加速了水中有机物的去除速率；③在营养液进行臭氧和紫外线消毒前过滤，减少了营养液中还原性物质和不透明杂质对消毒效果的影响，提高杀菌效果；④采用空压机对残留臭氧进行吹脱，使营养液中的臭氧浓度迅速下降，减少或避免对植物根系产生危害；⑤无土栽培换茬时不启动空压机，含有较高浓度微纳米气泡臭氧水的营养液在串联水培设施内进行数次循环，有效清除设施死角的病原菌；⑥可实现增氧、消毒双重功能，既能对营养液进行增氧，又能对营养液进行消毒，有效降低了单一设备的累加投资成本；⑦装置采用自动化控制，使用PLC和LED控制面板，操作简便；控制单元预留数据端口，可连接其他装置的控制单元，实现物联网综合控制。

适用范围

营养液微纳米气泡增氧消毒系统非常适用于水培，直接对营养液进行增氧、消毒。深液流水培（DFT）营养液的溶解氧随栽培槽长度的增加而降低，因此DFT种植槽长度不宜过长[14]。利用微纳米气泡技术增氧，其产生微纳米气泡具有缓释效果，可保证DFT种植槽末端的溶解氧浓度。

对于气雾栽培，营养液以喷雾的形式喷射出，在雾化的过程中营养液与空气充分接触，有效提高了营养液的溶解氧浓度，配以营养液循环流动方式，足以满足植物生长需要。因此，只需使用营养液微纳米气泡增氧消毒系统的消毒功能即可。

对于基质栽培，既可以通过控制滴灌流量及时间，使基质的透气性和持水性达到动态平衡而使根系获取充足的氧气，亦可利用营养液微纳米气泡增氧消毒系统进行增氧；基质栽培的营养液残液不再循环利用，排放前需经营养液微纳米气泡增氧消毒系统进行消毒，消毒之后可作为肥料用于大田灌溉。

推广应用

营养液微纳米气泡增氧消毒系统率先应用于北京农业嘉年华的蔬菜主题馆，该馆展示了各种新颖的无土栽培设施及蔬菜（图1～2）。营养液增氧方式包含了营养液循环流动、落差法和营养液微纳米气泡增氧消毒系统。该系统布置于地下贮液池附近，增氧时调节溶氧值10 mg/L左右（浓度范围>20 mg/L），与贮液池的营养液混合后将含有丰富溶氧值的营养液通过液循环流动供无土栽培蔬菜根系利用；消毒时调节臭氧浓度1 mg/L左右（浓度范围1～8 mg/L）对营养液进行消毒，消毒后采用空压机对残留臭氧进行吹脱处理，使营养液中的臭氧浓度迅速下降到0.1 mg/L，减少或避免对植物根系产生危害。增氧消毒后无土栽培内的作物无烂根现象和营养液病害，营养液微纳米气泡增氧消毒系统确保了无土栽培蔬菜保持良好的生长态势。

山东惠民鑫诚现代农业科技示范园也应用了营养液微纳米气泡增氧消毒系统（图3～4），园区内有2栋连栋温室，总建设面积为18276.48 m2，以荷兰高效无土栽培（椰糠基质培）生产模式为主。椰糠基质培除了应用间歇滴灌法增氧与紫外线消毒外，还应用营养液微纳米气泡增氧消毒系统对营养液进行增氧，收集的残液进行消毒后还可以应用于大田灌溉；该系统也可应用于园区的深液流水培韭菜，增氧消毒效果明显，韭菜根系发达，病害发生率极低。

应用展望

我国无土栽培的生产面积不断增加，与传统栽培模式相比，无土栽培可以有效克服保护地栽培中土壤盐渍、土传病害等连作障碍，在非耕地场所进行周年种植，并能提高单位面积产量和产品质量。无土栽培主要依靠营养液为作物提供所需养分，而营养液的增氧和消毒是无土栽培进行有效生产的关键。

目前，很多生态园区和农业园区在生产运营过程中，常常会遇到营养液增氧困难、易滋生藻类和病菌等问题，客户对营养液增氧消毒设施具有很强烈的需求。因此，该技术具有切实的推广市场。

营养液微纳米气泡增氧消毒系统由于集成了现有的增氧消毒优势技术及自控和物联网控制系统，成本相对比较高，这就决定了该系统需首先面向高经济附加值的蔬菜、水果、中药、花卉、食用菌等作物进行应用推广。其次，营养液微纳米气泡增氧消毒系统在生产与示范方面具有一定的应用，其增氧与消毒的基础研究有待进一步探索，以期为技术改进、降低成本、生产应用提供参考。

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微生物培养的方法第9篇

[关键词] 肾宁合剂；微生物限度检查；验证；大肠埃希菌

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（b）-0078-02

肾宁合剂是本院结合临床研制的医院制剂，由黄芪、益母草、败酱草、川芎等组成，具有益气活血、利水消肿、调节免疫功能的功效，用于急慢性肾炎、肾病综合征、糖尿病性肾病、急慢性肾功能衰竭等疾病。据调查目前微生物限度不合格是医院制剂不合格的主要因素之一[1]，为控制产品质量，本研究按照2010年版《中华人民共和国药典》（简称“中国药典”）附录的相关规定[2]，参考相关文献对肾宁合剂微生物限度检查方法进行了验证[3-4]，以保证患者用药的安全有效，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 供试品

肾宁合剂，规格：100 ml，由本院制剂室生产；批号：20120413。

1.2 培养基

营养琼脂培养基，批号：110116；营养肉汤培养基，批号：110112；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：110112；4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG），批号：100820；pH 7.0改良马丁琼脂培养基，批号：101106；无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号：100824。以上培养基均由北京三药科技开发公司提供。

1.3 验证试验用菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，黑曲霉（Aspergil1us niger）[CMCC（F）98003]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]。以上菌种均由中国药品生物制品检定研究院提供。

1.4 仪器和设备

SHINVA立式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司），超净工作台（蚌埠净化设备厂），LRH-250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），HTY-2000A集菌仪，HTY反复使用集菌培养器（杭州高得医疗器械有限公司）等。

2 细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证

2.1 菌液制备

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，经25℃培养18～24 h，取1 ml加入到9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5，为50～100 CFU/ml菌悬液备用。

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基上，经35℃培养18～24 h，取1 ml加入到9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6～10-7（50～100 CFU/ml）的菌悬液备用。

接种黑曲霉菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养5 d，加入0.05% 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 ml，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每毫升含孢子数50～100 CFU的孢子悬液，备用。

将上述5种菌液分别接种至相应的培养基上，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌，35℃培养2 d；黑曲霉、白色念珠菌，25℃培养2～3 d。

2.2 供试液制备

取供试品10 ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1︰10的供试液。

2.3 细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证

供试品对照组：取1∶10的供试液1 ml，立即倾注琼脂培养基，凝固后，置规定温度下，细菌培养 24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培养 48～72 h，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。试验组：取1∶10的供试液1 ml和50～100 CFU/ml试验菌，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基，5种试验菌株每株试验菌分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。菌液组：取各试验菌 50～100 CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，凝固后，置规定温度下，细菌培养24～48 h，白色念珠菌和黑曲霉菌培养48～72 h，测定所加入的实验菌数。

试验组回收率计算：回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%。

验证结果提示，5株试验菌人工染菌回收率达到70%以上，表明采用常规法做验证试验，方法可行（表1）。

3 控制菌检查方法的验证（常规法）

试验组：取1∶10的供试液10 ml和小于100 CFU/ml大肠埃希菌试验菌液加到100 ml胆盐乳糖増菌培养基中，35℃培养24～48 h。取培养物0.2 ml，接种至含MUG培养基5 ml的试管中，35℃培养24 h，在366 nm紫外灯下观察荧光，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。试验管MUG为阳性，靛基质试验为阳性，本底对照管为阴性。

阴性菌对照组：同试验组，取小于100 CFU的金黄色葡萄球菌加入到100 ml胆盐乳糖増菌培养基中。阴性菌对照组MUG为阴性，靛基质试验为阴性，本底对照管为阴性。

上述验证结果提示试验组检出了大肠埃希菌，而阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，说明可采用常规法对本品进行控制菌（大肠埃希菌）检查。

根据以上验证结果，肾宁合剂的微生物限度检查按照中国药典2010年版第一部附录微生物限度检查法（附录ⅧC）检查，细菌、真菌及酵母菌数测定和控制菌检查均可采用常规法检验。具体方法如下：

供试液制备：取本品供试液10 ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1∶10的供试液。

细菌数测定：取1∶10、1∶100、1∶1000的供试液，采用平皿法测定，符合规定。

真菌及酵母菌数测定：取1∶10、1∶100、1∶1000的供试液，采用平皿法测定，符合规定。

大肠埃希菌的检查：取1∶10的供试液10 ml，加入到胆盐乳糖增菌培养基100 mL中，依法检查，符合规定。

4 讨论

肾宁合剂是由多种中药材经水煎煮醇沉提取后制成的澄明液体，含有多糖、淀粉、蛋白质类物质，这些物质为微生物繁殖提供了营养条件。如果微生物度检查呈假阴性，当样品存放后使用，会产生大量微生物甚至致病菌，因此对肾宁合剂进行微生物限度检查具有重要意义[5]。

本试验中菌液经稀释至适宜浓度后，若在室温下放置，应在2 h内使用，若保存在2～8℃可在24 h内使用，以确保细菌活性及菌数稳定[6-7]。本试验经过考查证明，以1∶10肾宁合剂样品作为最低稀释级供试液，能够消除药品在微生物限度检查中的抑菌作用，5种试验菌的回收率均大于70%，表明稀释剂 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无抑菌作用[8]，对实验无干扰，符合中国药典要求。

[参考文献]

[1] 安富荣，张纯. 2004～2007年上海市医院制剂中抽检不合格制剂质量问题分析[J]. 中国药房，2008，19（28）：2211-2212.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-83.

[3] 马绪荣，苏德模. 药品微生物学检验技术[M]. 北京：华龄出版社，2007：209.

[4] 兰鸿，李元宏，杨务彬. 乳核内消液微生物限度检查方法学验证[J]. 医药导报，2011，30（6）：804-805.

[5] 马亮英，蒋磊. 小儿腹泻散微生物限度检查方法验证[J]. 中国现代药物应用，2011，20 （5）：123-124.

[6] 卜生高，王劲争. 喉咽清口服液微生物限度检查方法的验证[J]. 中国药事，2009，23（12），1210-12112.

[7] 袁汀. 清热合剂的微生物限度检查方法的验证[J]. 山西医药杂志，2011，40（9）：869-870.